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從哺乳動物細(xì)胞中制備核和細(xì)胞質(zhì)提取物
發(fā)布時間： 2023-01-06 點擊次數(shù)： 1406次材料與儀器
轉(zhuǎn)瓶或單層培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞（如HeLa細(xì)胞）
PBS 低滲緩沖液 高鹽緩沖液 含1. 2 mol L KCl 透析緩沖液 液氮
貝克曼 JS4. 2 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子 50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管（對較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管） Dounce 氏玻璃勻漿器（B 型研杵） Beckman JA-20 離心轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子磁性攪拌器或傾斜臺 Beckman JA-20 離心轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子磁性攪拌器或傾斜臺、 管型透析膜（14000 MWCO）、電導(dǎo)計步驟
1a) 收集轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞：將 5× 108?10× 108 細(xì)胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 離心 20 min。輕輕倒去上清并丟棄，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50 mL 錐形刻度離心管中（每管 2?3 L 培養(yǎng)液中的細(xì)胞）。進(jìn)行步驟 2。
1b) 收集單層培養(yǎng)的細(xì)胞：單層細(xì)胞長滿后去掉培養(yǎng)液。用足量 PBS 洗 1 次，PBS 用 量為沒過細(xì)胞，輕輕振蕩，棄 PBS。將細(xì)胞刮入新鮮 PBS 液里，倒進(jìn)錐形刻度離心管中。進(jìn)行步驟 2。
2) 1850 g 離心 10 min。進(jìn)行步驟 3a 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或步驟 3b 單層培養(yǎng)。
3a) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量壓緊后細(xì)胞的體積 (Pcv)將細(xì)胞重懸于約 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 離心10 min。進(jìn)行步 驟 4。
3b) 單層培養(yǎng)細(xì)胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量 pcv, 進(jìn)行步驟 4。
4) 快速地將沉淀的細(xì)胞重懸于 5 倍體積的低滲緩沖液中1850 g 離心 10 min 并棄掉上 清。
5) 將細(xì)胞沉淀重懸于 3 倍于原 pcv 的低滲緩沖液中，放置在冰上 10 min，讓細(xì)胞腫脹。
6) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)到 Dmmce 氏玻璃勻漿器中，用 B 號研杵上下抽提 10 次。用臺盼藍(lán)染色排斥法在顯微鏡下檢査細(xì)胞裂解情況（應(yīng)大于80%?90%)。
7) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)到離心管中。用 JS4.2 轉(zhuǎn)子 3300 g 離心 15 min 收集細(xì)胞核。保留上清用來制備 S-l00 細(xì)胞質(zhì)提取物。
8) 用離心管上的刻度測量第 7 步離心壓緊后的細(xì)胞核體積（pnv)。用 l/2 pnv 體積的低鹽緩沖液重懸細(xì)胞核。
9) 在輕輕攪拌的同時，逐滴加入1/2 pnv 體積（見步驟 8) 的高鹽緩沖液。必要時用 Dounce 氏玻璃勻裝器混勻。
10) 不斷輕輕攪拌 30 min 以提取核內(nèi)容物。
11) 用 Beckman JA-20 轉(zhuǎn)子 25 000 g 離心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并測量其電導(dǎo)率（見步驟 12)，這就是核提取物。
12) 將核提取物加入透析管中，用夾子至少封住透析袋的一端；透析袋一端是打開的， 這樣就可以測量透析袋內(nèi)核提取物的電導(dǎo)率，比較核提取物電導(dǎo)率和透析液電導(dǎo)率 的不同，以確定是否需要進(jìn)一步透析。在 50 倍體積的透析液中進(jìn)行透析，直到提 取物的電導(dǎo)率和透析液一致為止（即提取物的 KCr 濃度達(dá)到 100 mmol/L 時）。盡量縮短透析時間。
取 5?10 μl 提取物用水稀釋至 1 mL 用來測電導(dǎo)。用電導(dǎo)測量儀直接讀出稀釋液的電導(dǎo)值，與同樣稀釋的透析液的電導(dǎo)值相比較。
13) 將提取物從透析袋中移出，最后一次檢測其電導(dǎo)率以確定透析已經(jīng)完成。將提取物25000 g 離心 20 min, 棄掉沉淀。
14) 測定上清中蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)需要分裝，浸入液氮中速凍，-80℃保存。
注意事項
所有步驟的操作均在0?4℃進(jìn)行，在冷室內(nèi)操作更好。緩沖液和設(shè)備要預(yù)冷。所有離心均在4℃進(jìn)行，轉(zhuǎn)子要預(yù)冷。
以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物科技有限公司介紹：
安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。
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