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復(fù)蘇凍存細(xì)胞實驗
發(fā)布時間： 2022-12-06 點擊次數(shù)： 1407次原理
快速復(fù)蘇細(xì)胞，緩慢稀釋，以高細(xì)胞密度重新接種。
材料與儀器
步驟
材料
無菌
培養(yǎng)瓶（如果需要離心時）
生長培養(yǎng)基
吸量管，1ml，10ml
注射器和19號針頭（如果你使用玻璃凍存管）
非滅菌
保護性手套和面罩
37℃無菌水，10cm深，盛于清潔、用乙醇擦拭過的帶蓋的水桶中
鑷子
70%乙醇
棉簽
1%萘黑（酰胺黑）或0.4%臺盼藍(lán)
操作步驟
1.檢查凍存目錄，確定將要復(fù)蘇的凍存管的位置
2.收集所有材料，準(zhǔn)備培養(yǎng)基，標(biāo)記培養(yǎng)瓶
3.從凍存罐中取出凍存管，檢查標(biāo)簽，確定是否是所需要的凍存管，若小管未浸沒在液氮中，將小管放入塑料除菌水桶內(nèi)37℃的燒杯中。盡可能避免水沒過官帽，因為會增加污染的機會。
安全提示
將凍存管從液氮中取出時，必須穿實驗衣，戴手套。若凍存管浸沒在液氮中，則必須待面罩或護目鏡，也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，復(fù)蘇時將可能發(fā)生劇烈爆炸。該種情況下，必須使用帶蓋的塑料水桶進行復(fù)蘇，以控制-爆-炸。
4.當(dāng)凍存管復(fù)蘇時，再次檢查標(biāo)簽以確定為所需的細(xì)胞；隨后用70%乙醇徹-底擦洗凍存管，然后在超凈工作臺內(nèi)打開凍存管，
5.用1ml吸管將凍存管內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。
6.將培養(yǎng)基緩慢的加至細(xì)胞懸液中:以每2min 10ml的速率進行滴加。開始時逐滴加入，然后可加快，逐漸稀釋細(xì)胞和細(xì)胞保護劑。
對于需要通過離心去除細(xì)胞保護劑的細(xì)胞：
（a）按照步驟6，在離心管或常規(guī)容器內(nèi)緩慢稀釋細(xì)胞。
（b）100g離心2min。
（c）棄去含有細(xì)胞保護劑的上清培養(yǎng)液。
（d）以新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。
（e）接種入培養(yǎng)瓶。
7.凍存管內(nèi)殘留物可用萘黑或臺盼藍(lán)染色，以測定細(xì)胞的存活率。
8.24h后檢查：
（a）對于貼壁單層細(xì)胞，依據(jù)預(yù)測密度（個細(xì)胞/cm2)的細(xì)胞照片，確認(rèn)細(xì)胞是否貼壁，估計細(xì)胞存活率。
（b）對于懸浮生長的細(xì)胞，檢查外觀（清晰的細(xì)胞質(zhì)，缺乏細(xì)胞顆粒），稀釋至常規(guī)的接種濃度。若進行細(xì)胞技術(shù)，并估計細(xì)胞存活率后，接種濃度可能更精確，這種情況下， 可以將細(xì)胞稀釋至常規(guī)存活細(xì)胞接種濃度。注意事項
1. 將凍存管從液氮中取出時，必須穿實驗衣，戴手套。若凍存管浸沒在液氮中，則必須待面罩或護目鏡，也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，復(fù)蘇時將可能發(fā)生劇烈爆炸。該種情況下，必須使用帶蓋的塑料水桶進行復(fù)蘇，以控制-爆-炸。
2. 塑料凍存管在使用前要仔細(xì)檢查，以防管壁破裂或螺口不配套造成密封 不嚴(yán)。
3. 用DMSO作為凍存保護劑時，用前應(yīng)先將凍存液在4℃預(yù)冷，解凍后應(yīng)馬 上洗去保護劑。
常見問題
1. 檢查細(xì)胞活率。用1ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染料排除法檢查細(xì)胞存活率。
2. DMSO有-劇-毒，使用時要特別注意。此外，在凍存前越晚加入細(xì)胞越好，解凍后要盡快除去，以避免對細(xì)胞的毒害。
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安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)
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