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脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
發(fā)布時(shí)間： 2022-12-06 點(diǎn)擊次數(shù)： 1239次材料與儀器
L8057-Y10細(xì)胞 D-PBSA
培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)板 F12 FB培養(yǎng)基 G418(Invitrogen) 選擇性培養(yǎng)基 電穿孔 電穿孔專用杯 電穿孔儀II 電穿孔儀-II配套的效能擴(kuò)增器-Plus步驟
表達(dá)載體與 DNA 制備：
pSVTKGH，線性化 [ Selden et al.，1986]
此載體含有 SV 40 增強(qiáng)子及單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子序列，兩者可啟動(dòng)人類生 K 激素（hGH ) 基因表達(dá)。hGH 可直接分泌到組織培養(yǎng)基上，可通過(guò)放射免疫學(xué)分析法直接檢測(cè) [ Ravid et al.，1991 ]。
pcDNA3，線性化（Invitrogen )
該表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)上游含有人類巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子-啟動(dòng)子，下游含多聚腺苷酸信號(hào)及牛生長(zhǎng)激素（bGH ) 基因的轉(zhuǎn)錄終止序列。pcDNA3 載體還含有新霉素抗藥基因，用作篩選穩(wěn)定表達(dá)目的基因的抗性克隆。如本章方法中所述，pcDNA3 也可用作與報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染的篩選標(biāo)記。
1. 以 5X105個(gè)/ml 的濃度在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中接種 L8057-Y10 細(xì)胞（F12/FB 培養(yǎng)基）（含谷氨酰胺（2 mmol/L )，青霉素（50 U/ml ) 及鏈霉素（5 μg/ml ) 的 Ham’s F12 , 添加 10% FBS (熱滅活；GIBCO #16140-014)），并于 37°C，5% CO2 孵箱培養(yǎng)細(xì)胞。
2. 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，收集細(xì)胞，4°C ，380 g 離心 5 min。
3. 用 10ml D-PBSA 洗滌細(xì)胞沉淀，4°C，380 g 離心 5 min。
4. 用 5 ml 電穿孔緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞。
5. 4°C，380 g 再次離心 5 min，收集細(xì)胞。
6. 用電穿孔緩沖液將細(xì)胞制成密度為 1X106 個(gè)/0.8 ml 的細(xì)胞懸液。
7. 將 0.8 ml 的細(xì)胞移至預(yù)冷的電穿孔杯中。
8. 分別加入 50 μg 和 5 μg 線性 pSVTKGH 及線性 pcDNA3 （如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)特異基因啟動(dòng)子-報(bào)告基因表達(dá)，還需另設(shè)無(wú)質(zhì)粒 DNA 的電穿孔細(xì)胞，作為陰性對(duì)照）
9. 一只手緊握電穿孔杯，另一只手輕彈底部，以混勻 DNA-細(xì)胞懸液，將懸液于冰上孵育 10 min。
10. 在 400V /500 μF 條件下轟擊細(xì)胞懸液，并記錄時(shí)間。
11. 之后，取出電穿孔杯，在冰上擱置 10 min。
12. 將轟擊后的細(xì)胞移至盛有 10 ml F12/FB 的離心管中，另取少許培養(yǎng)基沖洗電穿孔杯，移回到離心管，離心，收集細(xì)胞。
13. 將細(xì)胞于 20 m l F12/FB 中再次懸浮，種到 75 cm2 培養(yǎng)瓶中，于37°C ，5 %CO2 培養(yǎng)箱中孵育，令新霉素抗性基因表達(dá)。
14. 24~48 h 后，離心收集細(xì)胞，然后用 20 ml 選擇性培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞。
15. 隨后，需每 2~4 天換液（選擇性培養(yǎng)基），以清除死亡細(xì)胞的碎片，并且使抗性細(xì)胞生長(zhǎng)，篩選過(guò)程至少需要兩周。
16. 測(cè)定 hGH 在細(xì)胞上清液的表達(dá)（見(jiàn) 27. 11.5 節(jié)）。以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
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安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)
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