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盤(pán)點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類(lèi)型及特點(diǎn)
發(fā)布時(shí)間： 2021-09-16 點(diǎn)擊次數(shù)： 4552次在分子生物學(xué)中，未知基因全長(zhǎng)序列的獲取是研究新基因的重要步驟。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列時(shí)，獲得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差異顯示技術(shù)、基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)等等......
背景介紹
今天我們來(lái)一起了解一種可從低豐度轉(zhuǎn)錄本中獲得cDNA末端序列的方法—RACE技術(shù)。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列，只知道其中的一段序列時(shí)，就可以通過(guò)RACE技術(shù)獲得mRNA兩端序列，再與已知序列拼接，從而得到完整mRNA序列。相比其他獲得mRNA全長(zhǎng)的技術(shù)，RACE具有簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的優(yōu)勢(shì)，因而得到較多的運(yùn)用。
RACE是什么？
RACE全稱(chēng)為rapid amplification of cDNA end，即cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，就是已知部分cDNA序列，基于mRNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)獲得完整的cDNA的 3'或5'末端的分子生物學(xué)技術(shù)。
RACE可以應(yīng)用在哪些實(shí)驗(yàn)方向？
構(gòu)建cDNA文庫(kù)
lncRNA全長(zhǎng)克隆
獲得抗體可變區(qū)序列
miRNA靶基因序列驗(yàn)證
已知基因一段序列，克隆旁側(cè)序列
獲得病毒基因組
......
總體來(lái)說(shuō)，就是用來(lái)測(cè)定cDNA序列，獲得RNA全長(zhǎng)序列。 RACE技術(shù)類(lèi)型及特點(diǎn)？
RACE技術(shù)有多種類(lèi)型，根據(jù)各個(gè)RACE技術(shù)原理的不同，適合于不同的RNA，快來(lái)跟著小編一起來(lái)了解下吧~
經(jīng)典RACE
經(jīng)典RACE技術(shù)是在1988年由Frohman等[1]發(fā)明。經(jīng)典RACE技術(shù)包括5'RACE和3'RACE，分別克隆cDNA的5'端和3'端。
1. 3'RACE利用真核生物mRNA 3'端具有poly A結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，使用5'端帶有接頭序列的oligo dT與之結(jié)合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA；
2. 再利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的上游引物和與接頭序列互補(bǔ)配對(duì)的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA 3'末端擴(kuò)增產(chǎn)物。
1. 經(jīng)典RACE技術(shù)中的5'RACE是利用根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的下游引物GSP作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成一鏈cDNA；
2. 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在新合成的cDNA 3'末端加上poly A；
3. 帶有接頭序列的Oligo dT引物與一鏈cDNA 3'末端的poly A結(jié)合，合成二鏈cDNA；
4. 再以第二鏈cDNA為模板，利用GSP和接頭引物作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA 5'末端擴(kuò)增產(chǎn)物；
得到的5'末端產(chǎn)物和3’末端產(chǎn)物可以通過(guò)克隆連接到適當(dāng)?shù)妮d體上，進(jìn)行測(cè)序獲得末端序列。將測(cè)序得到的cDNA末端序列，與已知的中間序列進(jìn)行拼接，就可獲得cDNA全長(zhǎng)序列。
經(jīng)過(guò)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，由經(jīng)典RACE又衍生出多種RACE技術(shù)，增加了RACE技術(shù)的適用廣泛性，我們?cè)賮?lái)一起了解下其他的RACE技術(shù)吧！
Cap-switching RACE
Cap-switching RACE針對(duì)mRNA發(fā)生斷裂的可能，進(jìn)行了技術(shù)優(yōu)化[2-4]。
1. Cap-switching RACE是以O(shè)ligo dT作為逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄獲得一鏈cDNA；
2. 當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄到mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)時(shí)，莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）會(huì)在新合成的cDNA的3'末端加上若干個(gè)胞嘧啶；
3. 接著，使用5'端帶有接頭、3'端帶有poly G結(jié)構(gòu)的接頭引物與cDNA 3'端的poly C互補(bǔ)配對(duì)，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)以接頭為模板合成cDNA，完成接頭轉(zhuǎn)化，新合成的一鏈cDNA 3'端就含有一段接頭序列；
4. 然后再利用接頭引物進(jìn)行PCR獲得RACE產(chǎn)物。
RLM-RACE
RLM-RACE技術(shù)的出現(xiàn)同樣也是為了擴(kuò)增到完整mRNA的5'末端，避免mRNA斷裂帶來(lái)的影響。
1. 首先在RNA體系中加入牛小腸堿性磷酸酶（CAP），特異性地識(shí)別并切除斷裂mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)；
2. 再向體系中加入煙草酸焦磷酸酶（TAP），切除mRNA 5'端完整的帽子結(jié)構(gòu)，使mRNA 5'端暴露出一個(gè)磷酸基團(tuán)；
3. 接著加入RNA連接酶將接頭與mRNA 5'端暴露的磷酸基團(tuán)連接，而切除了磷酸基團(tuán)的斷裂RNA則不能與接頭結(jié)合，這樣便獲得了5'端帶有接頭的完整mRNA；
4. 最后再進(jìn)行RT-PCR。
Adapter-Ligated RACE
Adapter-Ligated RACE技術(shù)同樣是為了獲得更長(zhǎng)的mRNA序列，但相對(duì)來(lái)說(shuō)不一定能獲得全長(zhǎng)mRNA序列[5]。
1. 向逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA體系中加入T4連接酶，利用T4連接酶將接頭連接到cDNA兩個(gè)末端上；
2. 短cDNA的退火溫度低，兩端接頭容易發(fā)生退火，形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)；
3. 長(zhǎng)的cDNA退火溫度高，不易形成鍋柄裝結(jié)構(gòu)，因此引物可以與接頭結(jié)合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
環(huán)形-RACE
環(huán)形-RACE使用一對(duì)基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，提高了PCR擴(kuò)增的特異性[6]。
1. 環(huán)形RACE是利用T4連接酶將cDNA的末端連接，形成cDNA的環(huán)化結(jié)構(gòu)或串聯(lián)結(jié)構(gòu)；
2. 根據(jù)mRNA上的已知區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物GSP，以GSP引物合成第二條cDNA鏈；
3. 在未知序列兩端根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)一對(duì)GSP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將未知序列置換到已知序列中間位置，得到中間是未知序列、兩端是已知序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。
RCA-RACE
RCA-RACE (rolling circle amplification rapid amplification of cDNA ends)類(lèi)似于環(huán)形RACE，但是RCA-RACE在環(huán)化的過(guò)程中并不會(huì)產(chǎn)生串聯(lián)結(jié)構(gòu)，PCR擴(kuò)增過(guò)程中所使用的引物既可以是特異性引物，也可以是隨機(jī)引物。PCR擴(kuò)增使用φ29聚合酶，這種酶的特點(diǎn)是會(huì)把酶前行方向上的前鏈從原來(lái)的模板鏈上進(jìn)行解鏈、移開(kāi)。RCA-RACE利用這種特點(diǎn)，可以讓模板上的每個(gè)點(diǎn)在第一輪反應(yīng)中，都有機(jī)會(huì)得到n個(gè)拷貝，產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。
RCA-RACE利用ATP依賴(lài)性的熱穩(wěn)定連接酶，將一條cDNA末端的5'磷酸基團(tuán)和3'羥基連接，形成單分子環(huán)狀DNA。再使用隨機(jī)引物或基因特異性引物，在φ29 DNA聚合酶的催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)。
RACE的技術(shù)特點(diǎn)對(duì)比
基于RACE技術(shù)原理，以下幾點(diǎn)可提高RACE實(shí)驗(yàn)的成功率：
1. 保證RNA模板的完整性。實(shí)驗(yàn)之前最好進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性。
2. 使用高特異性引物。如使用Vazyme的RACE引物設(shè)計(jì)軟件，軟件會(huì)給出多條合適的RACE引物，可選擇多條基因特異性引物進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)，提高成功率。
3.巢式PCR。應(yīng)用巢式PCR設(shè)計(jì)引物時(shí)，在引物中加入特異性序列和適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，一方面可以增加對(duì)目的片段的特異性克隆，另一方面也方便后續(xù)的測(cè)序和實(shí)驗(yàn) 安培可以提供
HiScript-TS 5'/3' RACE Kit（Vazyme #RA101）基于Cap-switching RACE原理開(kāi)發(fā)，試劑盒中包括5'RACE和3'RACE的所有組分，可分別獲得5'RACE和3'RACE的產(chǎn)物。
原理圖如下：
成功率高：經(jīng)測(cè)試RA101陽(yáng)性率可達(dá)到70 %以上
操作流程簡(jiǎn)便、體驗(yàn)感優(yōu)：步驟簡(jiǎn)化，一管內(nèi)完成模板轉(zhuǎn)換和一鏈cDNA合成；組分Mix形式，減少加樣步驟、降低加樣所帶來(lái)的污染
配套R(shí)ACE引物設(shè)計(jì)軟件和序列比對(duì)軟件：包含RACE實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)軟件和序列比對(duì)軟件，以及使用說(shuō)明文件，簡(jiǎn)化RACE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)
【參考文獻(xiàn)】
[1] Frohman M A，Dush M K，Martin G R． Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide prime［J］． Proc． Nat． Acad． Sci． USA，1988，85( 23) : 8998 － 9002．
[2] Matz M，Shagin D，Bogdanova E，et al． ． Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR［J］． Nucl． Acid Res． ，1999，27( 6) : 1558 － 1560．
[3] Schramm G，Bruchhaus I，Roeder T． A simple and reliable 5- RACE approach［J］． Nucl． Acid Res． ，2000，28( 22) : e96．
[4] Schmidt W M，Mueller M W． CapSelect: a highly sensitive method for 5'CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs［J］． Nucl． Acid Res． ， 1999，27( 21) : e31．
[5] Chenchik A，Diachenko L，Moqadam F，et al． ． Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5' and 3' ends by amplification of adaptor-ligated cDNA［J］． Biotechniques， 1996，21( 3) : 526 － 535．
[6] Maruyama I N，Rakow T L，Maruyama H I． cRACE: a simple method for identification of the 5' end of mRNAs［J］． Nucl． Acid Res． ，1995，23( 18) : 3796 － 3797．
[7] 徐燁, 劉雅婷, 代文瓊,等. 幾種主要的RACE技術(shù)及應(yīng)用 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2012, 014(002):81-87.
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