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搞定內參，駕馭 Western blot 已成功一半

發(fā)布時間： 2021-09-15　　點擊次數(shù)： 1641次

western blot 對絕大多數(shù)實驗新人而言，絕對是心中痛，一碰就要抓狂。沒辦法,誰讓導師發(fā)話了，WB 做不好，延畢就是分分鐘的事兒。這還真是讓小伙伴們感嘆道，WB 想說愛你不容易。那么為了*馴服 WB，獲得漂亮且理想的實驗結果，一個良好的參照體系就絕對是*的存在。
一般而言，良好的參照體系包括：
*體重計（分子量 marker）：可確定蛋白條帶對應的分子量大小
*光桿司令（空白對照）：不加一抗和二抗，用于檢測膜的性質的封閉效果
*好榜樣（陽性對照）：已知量標準產(chǎn)物的正對照，可檢測抗體的工作效率

*打醬油的（陰性對照）：不表達靶蛋白的組織或樣品，檢測抗體的特異性
*單飛者（二抗對照）：不加一抗，檢測二抗的特異性。
*校正者（內參對照）：檢測標本系統(tǒng)和抗體系統(tǒng)，減少蛋白定量、上樣過程中的誤差

內參君的初次登場
在此，小編就帶領大家一起來認識認知這位“有名"的內參君吧。內參（Internal Control），簡而言之，一般指的是由管家基因編碼表達的蛋白（Housekeeping Proteins），因其表達恒定被用于檢測蛋白表達水平變化時的參照物，可確保實驗結果的準確性。

Tips:
1）在一些文獻報道中，Erk2、TATA bindingprotein(TBP)以及 c-Jun、c-Fos 等也可被用于核蛋白的內參。
2）內參的選擇需要考慮實際的實驗環(huán)境。
eg：在細胞增殖相關試驗中，c-Jun 由于自身表達變化就不適合做內參;而在凋亡實驗時，TBP、Lamin 等也不適合作為內參。因此設計實驗方案的時候應該考慮這些因素并查詢相應文獻，在實驗過程中也應該注意如果內參表達出現(xiàn)異常，應考慮這方面因素。

鋒芒畢露的內參君
正所謂，養(yǎng)兵千日，用在一時?？墒呛芏鄬嶒灢锁B在選好內參之后，對下一步如何發(fā)揮內參君的本領感到一愁莫展。那么以下三個妙招可一解大家的燃眉之急。
1、超級簡便的標記內參使用法：只要在二抗孵育時加入 HRP 標記內參抗體，按照正常操作即可。
2 、普通內參：當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以*行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用膜再生液（P1650）洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。
3 、當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據(jù)蛋白質 Marker 的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。如此下來，各位小伙伴就可以坐等鋒芒畢露的內參君為我們擒獲漂亮且理想的內參圖片。

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