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細胞轉(zhuǎn)染全過程及ZETA LIFE解決方案
發(fā)布時間： 2025-04-28 點擊次數(shù)： 842次
細胞轉(zhuǎn)染指的是將外源遺傳物質(zhì)，如 DNA、RNA 等導入真核細胞的技術(shù)。依據(jù)原理差異，轉(zhuǎn)染方法主要分為化學介導（如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法）、物理介導（如電穿孔轉(zhuǎn)染法）和生物介導（如病毒感染）。不同方法各有優(yōu)劣，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作便利、轉(zhuǎn)染率較高，適用于多數(shù)細胞系；磷酸鈣共沉淀法雖成本低，但重復性欠佳，對細胞毒性較大；電穿孔轉(zhuǎn)染法可適用于難轉(zhuǎn)染細胞，但對細胞損傷較大；病毒感染轉(zhuǎn)染效率高，然而技術(shù)難度大，在普通實驗室較難普及。
細胞轉(zhuǎn)染全過程
準備階段
細胞培養(yǎng)：在轉(zhuǎn)染前 1 - 2 天，選取處于對數(shù)生長期的細胞接種至合適的培養(yǎng)器皿（如 6 孔板、24 孔板）。接種細胞密度保持在 30% - 50%，以保證轉(zhuǎn)染時細胞處于對數(shù)生長期，且擁有充足的生長空間。例如，HEK293 細胞倍增時間為 16 小時，可根據(jù)此調(diào)整接種密度與時間。
轉(zhuǎn)染試劑與核酸準備：依據(jù)細胞類型與實驗需求挑選適配的轉(zhuǎn)染試劑，同時準備好待轉(zhuǎn)染的核酸，確保其純度和濃度達標。比如，進行基因過表達實驗時，需準備高純度的質(zhì)粒 DNA；若開展 RNA 干擾實驗，則要準備相應的 siRNA。
培養(yǎng)基及其他試劑：備好無血清培養(yǎng)基、Opti - MEM 培養(yǎng)基用于轉(zhuǎn)染操作，同時準備常規(guī)細胞培養(yǎng)試劑，如抗生素、胰酶等。
轉(zhuǎn)染實施階段脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作（以 6 孔板為例）
稀釋核酸和脂質(zhì)體：分別取適量核酸和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，用 Opti - MEM 培養(yǎng)基稀釋。一般而言，DNA 用量在 0.5 - 2μg，脂質(zhì)體用量在 1 - 4μL，具體比例依試劑說明書和預實驗優(yōu)化。例如，某實驗中，將 4μg 質(zhì)粒用 200μl Opti - MEM 稀釋為 A 液，10μl lipo2000 用 200μl Opti - MEM 稀釋為 B 液。
混合孵育：將稀釋后的核酸和脂質(zhì)體輕輕混合，室溫孵育 15 - 20 分鐘，促使核酸和脂質(zhì)體形成復合物。如上述例子，將 B 液加入 A 液中，輕輕混勻，室溫靜置 20 分鐘。
更換培養(yǎng)基：吸除培養(yǎng)細胞的原培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基或 Opti - MEM 培養(yǎng)基輕柔洗滌細胞 1 - 2 次，然后添加適量無血清培養(yǎng)基。
加入轉(zhuǎn)染復合物：將孵育好的核酸 - 脂質(zhì)體復合物緩慢加入培養(yǎng)孔，輕輕晃動培養(yǎng)板，使復合物均勻分布于細胞表面。
培養(yǎng)：將細胞置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4 - 6 小時后更換為（血清）細胞培養(yǎng)基，維持細胞正常生長。
電穿孔轉(zhuǎn)染法操作
細胞準備：收集對數(shù)生長期細胞，用 PBS 洗滌后，使用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞密度至合適范圍。
電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置：根據(jù)細胞類型和轉(zhuǎn)染核酸類型，設(shè)置適宜的電脈沖參數(shù)，如電場強度、脈沖時間、脈沖次數(shù)等。例如，某些細胞可能需要 1000V/cm 電場強度，20ms 脈沖時間，1 次脈沖。
轉(zhuǎn)染操作：將核酸與細胞懸液混合，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，進行電穿孔操作。電脈沖在細胞膜上形成電勢差，誘導產(chǎn)生暫時的小孔，使核酸進入細胞。
細胞恢復：電轉(zhuǎn)后，將細胞迅速轉(zhuǎn)移至含（血清）細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中，置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使細胞恢復生長。
轉(zhuǎn)染后檢測階段
觀察細胞狀態(tài)：轉(zhuǎn)染后持續(xù)觀察細胞生長狀態(tài)與形態(tài)變化，留意是否存在細胞死亡、形態(tài)異常等情況，評估轉(zhuǎn)染對細胞的毒性影響。
檢測轉(zhuǎn)染效率
報告基因檢測：若使用帶有報告基因（如綠色熒光蛋白 GFP）的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，可在轉(zhuǎn)染后 24 - 48 小時，通過熒光顯微鏡觀察報告基因表達情況，統(tǒng)計熒光陽性細胞比例，評估轉(zhuǎn)染效率。
分子生物學檢測：采用 qPCR、Western blot 等技術(shù)，檢測目的基因 mRNA 或蛋白表達水平變化，判斷轉(zhuǎn)染后基因的表達情況。例如，通過 qPCR 檢測轉(zhuǎn)染前后目的基因 mRNA 表達量，計算相對表達倍數(shù)。
ZETA LIFE 解決方案ZETA LIFE 產(chǎn)品優(yōu)勢
Zeta Life 公司專注于細胞培養(yǎng)產(chǎn)品研發(fā)生產(chǎn)，其轉(zhuǎn)染試劑等產(chǎn)品具備顯著優(yōu)勢。產(chǎn)品在安全性上表現(xiàn)優(yōu)秀，生產(chǎn)過程遵循嚴格標準，最大限度降低對細胞的毒性。生產(chǎn)流程自動化且經(jīng)過驗證，符合 GMP 標準，保障了產(chǎn)品一致性，不同批次間產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠。在性能方面，針對多種難轉(zhuǎn)染細胞系，如 RAW264.7 細胞，能有效提高轉(zhuǎn)染效率。
針對不同細胞的轉(zhuǎn)染方案RAW264.7 細胞轉(zhuǎn)染方案
質(zhì)粒 DNA 準備：確保質(zhì)粒 DNA 濃度為 700ng/ul，溶解于無菌雙蒸水或超純水，且無內(nèi)毒素。可使用 QIAGEN 試劑盒去除內(nèi)毒素。
細胞接種與轉(zhuǎn)染時機：先將細胞接種到細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合度達 70% 左右時進行轉(zhuǎn)染。
復合物制備：將質(zhì)粒 DNA 與 Zeta Life 公司 Advanced DNA RNA 轉(zhuǎn)染試劑（貨號 AD600150）按照 1:1（如 12ug:12ul）比例直接混合，用移液器吹吸 10 - 15 次混勻，室溫靜止 10 - 15 分鐘。
轉(zhuǎn)染操作：將復合物加入含（血清）細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板，輕輕混勻，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。不建議將復合物加入無血清培養(yǎng)基。
后續(xù)培養(yǎng)與檢測：轉(zhuǎn)染 24 小時后對細胞正常換液，質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染 48 小時后通過熒光檢測轉(zhuǎn)染效率。
其他細胞系轉(zhuǎn)染參考：對于不同細胞系，Zeta Life 產(chǎn)品可依據(jù)細胞特性，在核酸與轉(zhuǎn)染試劑比例、細胞接種密度、轉(zhuǎn)染時間等方面進行優(yōu)化調(diào)整。例如，對于某些生長緩慢的原代細胞，可適當降低細胞接種密度，延長轉(zhuǎn)染時間，同時調(diào)整核酸與轉(zhuǎn)染試劑比例，以達到最佳轉(zhuǎn)染效果。在進行正式實驗前，建議開展預實驗，摸索適合特定細胞系的轉(zhuǎn)染條件。
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