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小分子蛋白如何跑WB?
發(fā)布時(shí)間： 2025-04-27 點(diǎn)擊次數(shù)： 981次在日常實(shí)驗(yàn)過程中，小分子蛋白是非常常見的，常見的凋亡蛋白如Bcl2、Caspase-3、Bax，自噬相關(guān)蛋白如LC3B等均為小分子蛋白，接下來將從以下幾個(gè)方面分享小分子蛋白跑Wb時(shí)的注意事項(xiàng)：
1. 配膠：整體配膠遵循蛋白分子量越小膠濃度越大的原則，對(duì)于小分子蛋白來說，分離膠濃度一般為12%-15%，對(duì)于小分子蛋白條帶可以分的更加清晰。同時(shí)在倒膠時(shí)濃縮膠的比例可以適當(dāng)增加到4：6，使其充分濃縮，后續(xù)電泳過程中一定程度上可以減少彌散。
2. 上樣：根據(jù)日常上樣經(jīng)驗(yàn)，建議在跑小分子蛋白時(shí)增加1倍上樣量，防止蛋白彌散過多。選擇marker時(shí)，選擇適用于小分子蛋白的marker，后續(xù)敷抗體時(shí)可以更清楚的進(jìn)行裁膜。電泳開始前可用1′loadingbuffer補(bǔ)齊未點(diǎn)樣的膠孔，防止兩邊不齊跑成“八"字。
3. 電泳：濃縮膠部分設(shè)置恒壓70V、30min左右，一般即可濃縮到一條線上之后調(diào)大電壓至110V，至所需蛋白區(qū)域全部分開為止。盡量避免長時(shí)間低電壓跑膠，易導(dǎo)致蛋白彌散過多。同時(shí)整個(gè)電泳過程中注意降溫。
4. 轉(zhuǎn)膜：由于小分子蛋白分子量小，吸附能力弱，因此轉(zhuǎn)膜時(shí)選擇0.22μm的PVDF膜，常規(guī)0.45μm膜容易穿透，剩余條件同正常蛋白一般可以滿足條件。
5. 封閉：快速封閉液或脫脂牛奶按正常條件封閉即可。裁膜時(shí)根據(jù)marker上下留出足夠多的空間。
6. 一抗孵育：在保證上述條件的基礎(chǔ)上，一抗是出好結(jié)果的關(guān)鍵一步，若沒前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，一抗的稀釋比一般按照說明書配置，若有前期實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，可適當(dāng)進(jìn)行比例調(diào)整，一抗?jié)舛冗^高最后顯影階段易出現(xiàn)雜帶，過低則可能看不到條帶。使用1′TBST緩沖液稀釋，4℃孵育過夜。
7. 后續(xù)二抗比例及孵育時(shí)間、顯影按常規(guī)操作即可。需要注意若抗體不好用或者蛋白難出結(jié)果，在敷完一二抗時(shí)可適當(dāng)延長洗膜時(shí)間及次數(shù)。注意事項(xiàng)：
1. 轉(zhuǎn)膜時(shí)，若蛋白分子量過小，可適當(dāng)提高甲醇比例（30%左右）改善吸附能力。
2. 跑小分子蛋白時(shí)marker盡量不跑到一張膜上，對(duì)于常見內(nèi)參GAPDH、Actin及Tubulin等來說，分離膠濃度大上述蛋白區(qū)域一般分不開或分離不完整，易導(dǎo)致內(nèi)參不齊。
以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者
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