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技術(shù)文章ARTICLE
細(xì)胞死亡的三種方式以及倆種凋亡細(xì)胞的檢測(cè)方法（Tunel、Annexin V）
發(fā)布時(shí)間： 2025-04-01 點(diǎn)擊次數(shù)： 782次細(xì)胞死亡
動(dòng)物細(xì)胞的死亡主要有三種方式：細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和細(xì)胞自噬。目前對(duì)動(dòng)物細(xì)胞凋亡的特征、機(jī)制和生物學(xué)功能的研究較為深入。
細(xì)胞凋亡也被稱為程序性細(xì)胞死亡 (programmed cell Death, PCD) 。PCD 最初是發(fā)育生物學(xué)中提出的概念, 其含義是發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的某 類細(xì)胞的大量死亡,而這種細(xì)胞死亡要求特定的基因表達(dá)。細(xì)胞凋亡的典型特征是DNA規(guī)律性斷裂為 180-200bp整數(shù)倍的片段,并暴露出3'-OH 末端, 在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)有規(guī)律的梯狀條帶。
細(xì)胞壞死是區(qū)別于細(xì)胞凋亡的另一種典型死亡方式。當(dāng)細(xì)胞受到意外損傷。如物理、化學(xué)因素或嚴(yán)重的病理性刺激的情況下細(xì)胞壞死才會(huì)發(fā)生。 此時(shí)細(xì)胞內(nèi) ATP 濃度下降, 細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡, 細(xì)胞質(zhì)膜受損, 細(xì)胞內(nèi)含物, 包括膨大和破碎的細(xì)胞器以及染色質(zhì)片段釋放到胞外, 引起 周?chē)M織的炎癥反應(yīng)。 與細(xì)胞凋亡不同, 細(xì)胞壞死過(guò)程中染色質(zhì)不發(fā)生凝集 , 也不產(chǎn)生有規(guī)律的 180-200 bp 的 DNA 降解片段, 而是被隨機(jī)降 解, 瓊脂糖凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)彌散性分布, 俗稱 u 拖尾 n 現(xiàn)象。
細(xì)胞凋亡
凋亡過(guò)程模式圖
正常細(xì)胞 2.細(xì)胞凋亡的起始 3.凋亡中的細(xì)胞 4.凋亡小體被鄰近吞噬細(xì)胞吞噬
細(xì)胞凋亡檢測(cè)方式
細(xì)胞凋亡檢測(cè)有很多途徑和方式, Annex in v 法早期凋亡檢測(cè), 線粒體膜通透性變化檢測(cè), 凋亡蛋白酶活力檢測(cè), TUNEL檢測(cè), DNA ladder 電泳檢測(cè)等等。目前應(yīng)用范圍最大的是能夠?qū)υ缙诘蛲鲞M(jìn)行檢測(cè)的Annexin V法，和能夠區(qū)分壞死和凋亡細(xì)胞并特異性標(biāo)記出細(xì)胞凋亡的TUNEL法。
A Annex in V檢測(cè)
檢測(cè)原理：
在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。這一改變被認(rèn)為是特異性的，并且可作為凋亡細(xì)胞表面改變的標(biāo)記。Annexin V是一類廣泛分布于真核細(xì)胞胞漿內(nèi)的鈣離子依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，分子量為35~36KDa，能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中外翻到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合，被作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期的靈敏指標(biāo)之一。
以經(jīng)典方法 Annex in V-FIT C/PI 為例。 用標(biāo)記了 FITC 的 Annex in V 作為熒光探針, 再結(jié)合核酸染料碘化丙啶 (prop idi um lodi de, PI ), 利 用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生, 并對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行分群。 原理如下 :
FITC 標(biāo)記的 Annex in V保留了與 PS 的高親和力, Annex in V-FIT C 染色可在凋亡早期就檢測(cè)到外翻的 PS, 識(shí)別出凋亡的發(fā)生。PI 是一種 核酸染料, pl 不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜, 但可穿透膜損傷的細(xì)胞, 如晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合，將細(xì)胞核染色，可用來(lái)區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞。
方法優(yōu)勢(shì):
Annex in V 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡主要有三大優(yōu)勢(shì):1）特異性標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞膜表面的PS，聯(lián)用核染料，對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行分群和定量
2）精確反應(yīng)細(xì)胞群體的凋亡趨勢(shì)
3）操作自由度高，發(fā)射波長(zhǎng)不一致的情況下可兼容共染
數(shù)據(jù)展示
下圖使用Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A211)進(jìn)行凋亡檢測(cè)。使用不同濃度的喜樹(shù)堿（Camptothecin,CPT）誘導(dǎo)健康Jurket細(xì)胞（人T淋巴瘤細(xì)胞）凋亡，并同時(shí)做競(jìng)爭(zhēng)封閉實(shí)驗(yàn)，證明Annexin V-FITC的染色特異性。
結(jié)果表明，Annexin V法可以對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行分群（左下角細(xì)胞為未凋亡細(xì)胞，右上角為晚期凋亡細(xì)胞）并且可以對(duì)不同程度的凋亡進(jìn)行區(qū)分
Annexin V-FITC/PI 染色檢測(cè)不同程度凋亡
用喜樹(shù)堿CPT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)濃度分別為0、4、8、12、16uM，分別誘導(dǎo)4h后，參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖，（A）0 uM.（B）4 uM.（C）8 uM.(D)12 uM.(E)16 uM.(F)競(jìng)爭(zhēng)封閉實(shí)驗(yàn)，采用16uM CPT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞4h后，參照說(shuō)明書(shū)收集并洗滌細(xì)胞，于染色前加入無(wú)燃料標(biāo)記的Annexin V蛋白孵育10min,再進(jìn)行Annexin V-FITC/PI染色。無(wú)染料標(biāo)記的Annexin V結(jié)合了細(xì)胞上的PS，再進(jìn)行染色時(shí)，Annexin V-FITC無(wú)法結(jié)合PS，這說(shuō)明了染色的特異性。
B TUNEL法
檢測(cè)原理：
TUNEL 測(cè)定法是一種末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法。這一方法借助一種可觀測(cè)的標(biāo)記物，如熒光素，能對(duì)凋亡細(xì)胞的核DNA中產(chǎn)生的3’-OH末端進(jìn)行原位標(biāo)記。使用熒光顯微鏡即可進(jìn)行觀察。TUNEL法中，直接標(biāo)記步驟少，操作簡(jiǎn)便，間接標(biāo)記有信號(hào)放大的作用，檢測(cè)靈敏度高，是目前檢測(cè)細(xì)胞凋亡最為常用、最為普遍的檢測(cè)方法之一。
TUNEL 根據(jù)標(biāo)記物的不同，可以分為熒光法和顯色法兩種，熒光法需要使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，主要顯示的是細(xì)胞核的狀態(tài)，顯色法使用普通光學(xué)顯微鏡即可進(jìn)行觀察，更方便對(duì)組織細(xì)胞本身的情況進(jìn)行觀察。
方法優(yōu)勢(shì)：
1）特異性標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而不標(biāo)記壞死細(xì)胞；
2）相對(duì)于Annexin V從細(xì)胞群體角度反映凋亡，TUNEL法更有利于觀察組織、細(xì)胞的整體凋亡狀態(tài)；
3）TUNEL法使用樣本更廣：石蠟切片、冰凍切片、貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞；
4）方法兼容度高，可以根據(jù)自身需求進(jìn)行免疫組化、免疫熒光共染等操作；
數(shù)據(jù)展示
Hela細(xì)胞爬片（共染GAPDH）
使用DNase I 室溫處理10min后進(jìn)行TUNEL染色
使用產(chǎn)品：TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A113)
A:DAPI B:TUNEL染色，標(biāo)記凋亡細(xì)胞 C：GAPDH D：Merge
小鼠肝臟石蠟切片
使用產(chǎn)品：TUNEL Colorimetric Apoptosis Assay Kit(Vazyme #A114)進(jìn)行染色
凋亡系列產(chǎn)品選購(gòu)指南
安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國(guó)。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)?？梢栽诘谝粫r(shí)間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠?yàn)閺V大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們?cè)谌珖?guó)主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊(duì)伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶提供服務(wù)
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