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分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--四、定點(diǎn)突變
發(fā)布時(shí)間： 2025-03-24 點(diǎn)擊次數(shù)： 843次四、定點(diǎn)突變
定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò) 增
1. 引物設(shè)計(jì)要求：5’- 15-21bp 反向互補(bǔ)區(qū)域 + 至少 15bp 非互補(bǔ)區(qū)域 -3’，反向互補(bǔ)區(qū)域 GC含量 40%-60%，待突變位點(diǎn)至引物 3 ’ 端 Tm 值 >60°C。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇對應(yīng)模塊進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；
2. 建議使用試劑盒搭配的擴(kuò)增模塊進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序；
3. PCR 擴(kuò)增體系的模板質(zhì)粒投入量推薦 50 μl 體系投入 1 ng，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)應(yīng)當(dāng)≤ 35 個(gè)。擴(kuò)增產(chǎn)物DpnI消化和純化回收
1.取 5μl 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶后，剩余產(chǎn)物使用 DpnI 消化（45μl 擴(kuò)增產(chǎn)物加入 1 μl DpnI，輕輕吸打混勻后，在 PCR 儀中 37°C反應(yīng) 1-2 h消化質(zhì)粒模板，再 70°C反應(yīng) 15 min 使 DpnI 失活）；
2. 推薦使用切膠回收的方式純化（切膠時(shí)間最好控制在 3 min 內(nèi)，避免紫外照射對 DNA 的損傷），回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測，濃度應(yīng)≥ 20ng/μl，并跑膠鑒定回收產(chǎn)物是否為單一目的條帶；3. 回收濃度低時(shí)，可通過增加反應(yīng)體系，采取多管反應(yīng)單管回收的方式，提高回收產(chǎn)物的濃度。
重組反應(yīng)
1.連接反應(yīng)體系按照說明書要求計(jì)算投入量，體系中各組分投入體積≥ 1μl，若濃度過高可稀釋后使用；
2.連接反應(yīng)程序按照說明書要求進(jìn)行，建議在 PCR 儀中反應(yīng)。感受態(tài)轉(zhuǎn)化
1. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞選擇使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞；
2. 感受態(tài)細(xì)胞不可反復(fù)凍融使用，-80°C取出后建議一次用完；
3. 重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細(xì)胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細(xì)胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細(xì)胞；
4. 熱激時(shí)間：按照感受態(tài)細(xì)胞說明書操作進(jìn)行；
5. 平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致；
6. 菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g，3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。常見問題分析：
質(zhì)粒模板無法正常擴(kuò)增
1. 引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤：反向互補(bǔ)區(qū)域長度應(yīng)為 15-21bp 之間，過長過短均影響重組效率；GC 含量以 40-60% 之間最適，超出范圍影響重組效率。建議使用 CE Design 在線設(shè)計(jì)；
2. 質(zhì)粒模板質(zhì)量差：凝膠電泳檢測質(zhì)粒模板，若出現(xiàn)開環(huán)、線性條帶、拖尾等條帶，說明模板質(zhì)量差，需重新制備；
3. PCR 反應(yīng)體系 / 程序設(shè)置不當(dāng)：質(zhì)粒模板投入量過多會抑制 PCR 反應(yīng)，建議 50μl 體系投入 1ng；基于上下游引物 Tm 值，設(shè)定適宜范圍進(jìn)行梯度摸索；質(zhì)粒長度超過 8kb 時(shí)，可嘗試變更為雙 / 多點(diǎn)突變策略，分段擴(kuò)增。非目標(biāo)位點(diǎn)堿基突變
1. 測序克隆數(shù)過少：測序克隆數(shù)只有 1 個(gè)時(shí)，測序信息部分可信，建議多測幾個(gè)單克隆，檢查突變處的測序信號是否有問題，分析突變是否從模板引入；2. 突變位置：若堿基突變位于引物處，建議重新合成引物再次實(shí)驗(yàn)；位于其他部位的突變，應(yīng)當(dāng)使用高保真酶重新制備模板再次實(shí)驗(yàn)。
目標(biāo)位點(diǎn)未成功突變 / 假陽性
1. 質(zhì)粒殘留，重組效率低：質(zhì)粒模板投入量過多會抑制 PCR 反應(yīng)，建議 50μl 體系投入 1ng；使用 DpnI 消化擴(kuò)增產(chǎn)物并切膠回收；2. 重組反應(yīng)體系不符合要求：產(chǎn)物切膠回收且回收濃度不低于 20ng/μl；回收產(chǎn)物按說明書
安培生物致力成為推動生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)?？梢栽诘谝粫r(shí)間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠?yàn)閺V大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊(duì)伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶提供服務(wù)
公式計(jì)算投入量；濃度過高時(shí)需稀釋使用，保證體系投入體積不小于 1μl。
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