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技術(shù)文章ARTICLE
實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用及結(jié)果分析--相對(duì)定量和絕對(duì)定量
發(fā)布時(shí)間： 2025-03-07 點(diǎn)擊次數(shù)： 861次第三章：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的應(yīng)用
一、相對(duì)定量
測(cè)定不同樣品中基因表達(dá)量的相對(duì)值。
內(nèi)參基因的選擇
(1)始終選擇表達(dá)充沛、均一的基因做為內(nèi)參基因；
(2)不要盲目選擇常用的內(nèi)參基因；
(3)常用內(nèi)參基因：GAPDH，Actin，Tublin。
內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要，決定結(jié)果的有效性
加入內(nèi)參基因后：
結(jié)果計(jì)算
二、絕對(duì)定量
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定樣品中基因表達(dá)量的絕對(duì)值 ( 拷貝數(shù) )。
標(biāo)準(zhǔn)品：具有明確拷貝數(shù)濃度的樣品
A/ 克隆質(zhì)粒 B/ PCR 產(chǎn)物 C/ cDNA ( 擴(kuò)增效率測(cè)定等用途可以使用，絕對(duì)定量不能使用 )
拷貝數(shù)計(jì)算
平均分子量（MW）:
dsDNA=( 堿基數(shù) ) x (660 道爾頓 / 堿基 )
ssDNA=( 堿基數(shù) ) x (330 道爾頓 / 堿基 )
ssRNA=( 堿基數(shù) ) x (340 道爾頓 / 堿基 )
拷貝數(shù)計(jì)算公式 : (6.02 x 1023 拷貝數(shù) / 摩爾 ) x ( 濃度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml
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