-
miRNA實驗解決方案（操作手冊）---第四章：Small RNA 建庫
發(fā)布時間： 2025-01-08 點擊次數(shù)： 1272次一、Small RNA 的概念
Small RNA是長度小于200nt的一類非編碼RNA，承擔(dān)著關(guān)鍵性的調(diào)控功能，主要包括三類，分別是miRNA、piRNA以及 siRNA，其中以miRNA研究最為廣泛。Small RNA的5'和3'末端分別有自由的磷酸基和羥基，正是基于這一結(jié)構(gòu)特點，Small RNA測序采用5'、3'兩端連接接頭法進行Small RNA文庫構(gòu)建。
二、Small RNA建庫的原理
1.3'接頭連接
將RNA和3'接頭置于70℃條件下進行變性，打開RNA及3'接頭可能存在的二級結(jié)構(gòu)。利用酶將 Small RNA的3'羥基和3'通用接頭進行連接。
2．多余3'接頭封閉
為了防止多余的3'接頭與5'接頭連接產(chǎn)生接頭二聚體，在5'接頭連接之前，需要將多余的3'接頭進行封閉。封閉是通過加入RT Primer與多余的3'接頭反向互補形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而有效阻止其與5'接頭連接，達到減少接頭二聚體的目的。
3.5'接頭連接
5'接頭連接是基于Small RNA的5'端含有磷酸基團，利用酶將5'接頭與Small RNA進行連接。如需要測試的Small RNA 5'端不含磷酸基團，則連接不上5'接頭。5'接頭為RNA接頭，自身可能形成二級結(jié)構(gòu)，使用前需要將5'接頭的二級結(jié)構(gòu)打開。
4．cDNA合成
利用3'接頭封閉時加入的RT Primer作為引物進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
5．PCR富集
使用帶有P5、P7的引物進行文庫富集。
6．文庫分選
擴增后的文庫會有擴增引物殘留及rRNA污染。純化后的文庫推薦使用PAGE膠進行分選，可直觀獲得目的條帶。也可以使用雙輪磁珠分選，但分選范圍較廣，得到的Small RNA文庫純度較低。分選后的文庫miRNA在147bp處左右。
三、Small RNA建庫的操作流程·Small RNA 建庫
Vazyme 針對 lllumina 高通量測序平臺定向開發(fā)的Small RNA文庫構(gòu)建專用試劑盒-VAHTS Small RNA Library Prep Kit for lllumina V2 (Vazyme #NR811)。
· Vazyme ＃NR811 產(chǎn)品優(yōu)勢
1．文庫豐度高：接頭污染少，有效文庫比例高，miRNA比例高、覆蓋種類多，文庫數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠；
2．樣本兼容范圍廣：動、植物細胞／組織總RNA，分離純化的Small RNA，以及其他類型總RNA（如外泌體總RNA）均可作為起始模板；起始模板投入低至10ng總RNA；
3．多種純化方式可選：NR811中包含文庫構(gòu)建所需的所有組分，提供磁珠分選和PAGE膠分離兩種文庫純化方式，可根據(jù)起始文庫質(zhì)量任意選擇。
自備材料
1.Small RNA Index Primer
VAHTS Small RNA Index Primer Kit for Illumina (Vazyme #N813-816)。
2．RNA質(zhì)控
Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent #5067-1513)。
3．文庫質(zhì)控
Agilent DNA 1000 kit (Agilent #5067-1504)、Agilent High Sensitive Kit (Agilent #5067-4626)。
4．文庫純化
VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411)。
5．文庫分選
5.1PAGE膠分選：
6% Novex TBE PAGE gel 1.0 mM 10-well (Life Technologies #EC6265BOX)、5 x TBE、Ultra GelRed Nucleic Acid Stain （Vazyme ＃GR501）或 SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain（Life Technologies ＃S11494）、3M醋酸鈉（pH 5.2）、無水乙醇、新鮮配制的80％乙醇。
5.2磁珠分選：
VAHTS DNA Clean Beads（Vazyme ＃N411）、新鮮配制的80％乙醇。
6．其他材料
Nucleas-free ddH2O、RNase-free PCR管、低吸附EP管（Eppendorf＃022431021）； Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品、PCR儀、磁力架、-80℃冰箱、水浴鍋、離心機。
·注意事項
1．試劑盒各組分應(yīng)于標(biāo)注條件下保存：
1.15'接頭RL5 Adaptor為RNA接頭，請置于-85～-65℃保存。
1.2 試劑盒中的各酶類組分，請置于-30～-15℃保存。使用前混勻并進行短暫離心，避免粘附于管壁及管蓋，造成損失；使用時應(yīng)置于冰上，使用后及時按條件保存，否則會導(dǎo)致酶活降低。
1.3 RL3 Buffer V2比較粘稠，解凍混勻后請短暫離心收集至管底，避免液體粘附于管蓋和管壁，導(dǎo)致試劑損失。
2．RNA樣品質(zhì)控：
為保證建庫質(zhì)量，實驗開始前請對RNA樣品進行質(zhì)控，RNA樣品總量、純度和完整性應(yīng)滿足以下條件：
2.1以總RNA為起始模板，請使用沉淀法（如trizol法）或者Small RNA專用提取試劑盒提取RNA樣品，確保所使用的提取方法不會損失 Small RNA。
2.2總RNA模板的起始投入量應(yīng)≥10ng，若起始投入量過低，不能確保文庫構(gòu)建成功。
2.3 OD260／280比值介于1.8-2.2之間，使用Bioanalyzer進行RNA完整性檢測，RIN值27；使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，則28S：18S≥1.5，且無蛋白質(zhì)和基因組污染。
3．操作過程注意事項：
3.1實驗過程中請使用RNase-free的槍頭、EP管、PCR管，吸取不同樣品時請更換槍頭。
3.2 請佩戴手套、口罩操作，接觸RNase-free空間外設(shè)備或其他工作區(qū)間后，請更換手套。
3.3 所有的試劑使用后請立即蓋上管蓋，避免污染。
3.4實驗過程中如需暫停，請嚴(yán)格按照使用方法中注明的可停放點將樣品置于合適的溫度下保存，不正確的停放可能會降低建庫成功率。
實驗流程
1.3'接頭連接
將RL3 Adaptor、RL3 Buffer V2、RL3 Enzyme mix V2取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。
不同起始量RNA投入，所需接頭量不同，接頭量不足產(chǎn)出不夠，接頭過量則接頭二聚體殘留較多。推薦按照下表對接頭進行稀釋、如血清、血漿、外泌體RNA提取產(chǎn)物低于Qubit測定下限，則按照最大體積6μl投入，推薦按照10ng總RNA接頭稀釋倍數(shù)進行稀釋。
1.1 模板與接頭變性
將RNA底物自身以及RNA底物之間可能存在的二級結(jié)構(gòu)打開。根據(jù)模版RNA起始投入量稀釋 RL3 Adaptor，在RNase-free的PCR管中按照下表配制反應(yīng)體系。
1.2將PCR管置于提前預(yù)熱至70℃的PCR儀中反應(yīng)2min，反應(yīng)結(jié)束后立即取出置于冰上2 min。
1.3向1.2的反應(yīng)管中依次加入如下組分：
1.4使用移液器吹打10-15次充分混勻，短暫離心收集反應(yīng)液至管底。將反應(yīng)管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：
2．多余3'接頭封閉
將RT Primer取出，解凍并混勻，短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。
2.1 根據(jù)模版RNA起始投入量，參照表格稀釋RT Primer，再按照下表配制反應(yīng)體系。
2.2 使用移液器吹打10～15次混勻，短暫離心收集至管底。置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：
3.5'接頭連接
將5'接頭RL5 Adaptor、RL5 Buffer和RL5 Enzyme mix取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。
3.1 5'接頭變性
RL5 Adaptor 自身可能形成二級結(jié)構(gòu)，使用前需變性打開二級結(jié)構(gòu)。根據(jù)模版RNA起始投入量，參照表格稀釋RL5 Adaptor，將稀釋好的RL5 Adaptor置于提前預(yù)熱至70℃的PCR儀中反應(yīng)2min，反應(yīng)結(jié)束后立即取出置于冰上。
3.2 按照下表配制5'接頭連接反應(yīng)體系：
3.3 使用移液器吹打10～15次充分混勻，短暫離心收集反應(yīng)液至管底。將反應(yīng)管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：
4． cDNA合成
將RT Buffer和 RT Enzyme mix V2取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用。
4.1 按照下表配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：
4.2 使用移液器吹打10～15次充分混勻，短暫離心收集反應(yīng)液至管底。將反應(yīng)管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：
5．文庫富集
將Universal Primer、Index Primer和 Amplification mix 3取出，解凍混勻后置于冰上備用。5.1 按照下表配制反應(yīng)體系：
5.2將上述反應(yīng)液混勻，短暫離心收集至管底。將反應(yīng)管置于熱蓋的PCR儀中運行如下反應(yīng)程序：
6．PCR產(chǎn)物純化
6.1 將VAHTS DNA Clean Beads提前30 min從2～8℃取出，靜置使其平衡至室溫。
6.2 顛倒或渦旋振蕩使VAHTS DNA Clean Beads 充分混勻，吸取180μl（1.8x）加入到PCR產(chǎn)物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。
6.3 室溫孵育10min，使DNA結(jié)合到磁珠上。
6.4 將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約10min），小心移除上清。
6.5 保持樣品始終處于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。
6.6 重復(fù)6.5一次。
6.7 保持樣品始終處于磁力架上，室溫下開蓋干燥磁珠約5min。
加入80％乙醇時不要吹散磁珠。
最后移除上清時需使用10μl移液器將殘留液體吸干凈，避免磁珠過分干燥（龜裂）而降低回收效率。
6.8 將樣品從磁力架上取出，加入30μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心吸取28μl上清至一個新的Nuclease-free PCR管中。
洗脫產(chǎn)物可在-30～-15℃暫存一周。
6.9 Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測文庫：取1μl純化后的PCR產(chǎn)物用 Agilent DNA 1000 chip分析，由于2100遷移率的影響，最終文庫的主峰分布可能存在約6-8bp偏差，如下圖所示：miRNA文庫的峰在143-147 bp處，piRNA文庫的峰在153-156bp處。
注：A圖和B圖分別為1μg、100ng小鼠肝臟總RNA起始的Small RNA文庫，147 bp處的主峰為miRNA；C圖為1μg小鼠腎臟總RNA起始的Small RNA文庫，147 bp處的主峰為miRNA，153 bp處的主峰為piRNA。
7.文庫分選
根據(jù)6.9步驟中文庫質(zhì)控的結(jié)果選擇文庫分選純化方式，如2100圖顯示120 bp處有較多接頭二聚體、70-80 bp處有較多擴增引物殘留以及160bp和190 bp處有明顯的rRNA，則建議選擇PAGE膠分離；如接頭二聚體、擴增引物殘留以及rRNA較少則可以選擇磁珠進行文庫分選。為確保最終有效文庫的比例，建議使用PAGE膠進行文庫分選。方案A：6％非變性PAGE膠分選文庫
（1）將6％10孔非變性PAGE膠裝置于電泳槽中，向其中加入適量1xTBE電泳緩沖液。
（2）向純化的PCR產(chǎn)物中加入5μl6xLoading Buffer 混勻后離心收集至管底。
（3）取5μl pBR322／Mspl digest DNA Marker緩慢加入PAGE膠樣孔中。
（4）將混有Loading Buffer的PCR產(chǎn)物緩慢加入PAGE膠樣孔中，每個樣品上兩個樣孔，每孔15μl。
（5）上樣完成后，120-150V電壓電泳約1h，不同的電泳裝置電泳遷移速率可能不一致，所需電泳時間有差異，待樣孔中的Loading Buffer藍色指示劑全部跑出膠板后約3-5min方可停止電泳。
（6）將PAGE膠從電泳裝置中取出，將PAGE膠從膠板上剝下。用Gel-red核酸染料染色10 min，在凝膠成像儀中進行觀察，如下圖所示，大約140bp和150 bp處的條帶分別對應(yīng)于miRNA文庫和piRNA文庫的條帶。
（7）用刀片將對應(yīng)的條帶割下放于事先準(zhǔn)備好的500μl低吸附EP管中（管底已用酒精燈燒過的1ml注射器針頭戳了數(shù)個小洞），將500 μl EP管套到1.5ml低吸附EP管中，12,000 rpm（13,800xg）離心2min碾碎膠條。膠條的碾碎程度取決于500μl EP管底部小洞的孔徑，所以只需使用注射器針頭戳穿即可。
（8）離心完成后棄掉500μl EP管，向裝有PAGE膠碎片的1.5ml EP管中加入250 μl GEBuffer，于50℃水浴鍋中溫育1-2h。
（9）將步驟8的EP管于離心機中12,000 rpm（13,800xg）離心2min，將蒸發(fā)到管壁的液體收集至管底。
（10）將步驟9的上清轉(zhuǎn)移至離心過濾柱 Filtration Column中12,000 rpm（13,800xg）離心2 min 收集液體，棄去離心柱，將液體轉(zhuǎn)移至新的1.5ml低吸附EP管中。
（11）向步驟10的上清中分別依次加入5μl Co-precipitator，30 μl 3M醋酸鈉（pH 5.2）和1ml無水乙醇，振蕩混勻后于-80℃沉淀1h。
（12）取出-80℃沉淀產(chǎn)物，于預(yù)冷至4℃的冷凍離心機中12,000 rpm（13,800xg），離心30 min。
（13）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀。向EP管中加入1ml新鮮配制的80％乙醇，于預(yù)冷至4℃的冷凍離心機中，12,000 rpm（13,800xg）離心10min。
（14）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀。短暫離心將管壁上殘留的液體收集至管底，小心移除殘留液體，室溫開蓋干燥約10min。
（15）待步驟14產(chǎn)物中殘留的酒精全部揮發(fā)，加入15μl Nuclease-free ddH2O溶解沉淀。
（16）2100檢測分選純化的文庫：取1μl分選純化的產(chǎn)物用Agilent high sensitive chip分析，良好的文庫應(yīng)該如下圖所示，對應(yīng)的miRNA文庫條帶在147-149bp處。
方案B：雙輪磁珠分選文庫
（1）將VAHTS DNA Clean Beads提前30 min從2～8℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫。
（2）顛倒或渦旋振蕩使VAHTS DNA Clean Beads充分混勻，取25μl純化的PCR產(chǎn)物于200 μl PCR管中吸取32.5μl 磁珠（1.3x）加入到PCR產(chǎn)物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。
( 3）室溫孵育5min，使DNA結(jié)合到磁珠上。
（4）將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心移取上清至新的Nuclease-free PCR管中。
（5）向步驟4的產(chǎn)物中加入22.5μl磁珠（0.9x），使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。（6）室溫孵育5min，使DNA結(jié)合到磁珠上。
（7）將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心棄去上清。
（8）保持樣品始終處于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫下孵育30sec，小心移除上清。
（9）重復(fù)步驟8一次。
（10）保持樣品始終處于磁力架上，室溫下開蓋干燥磁珠約5min。加入80％乙醇時不要吹散磁珠；最后移除上清時需要使用10μl移液器將殘留液體吸干凈；應(yīng)避免磁珠過分干燥（龜裂）而降低回收效率。
（11）將樣品從磁力架上取出，加入17.5 μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器輕輕吹10次打充分混勻，室溫靜置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心吸取15μl上清至一個新的Nuclease-free PCR管中。
（12）2100檢測分選純化的文庫：取1μl分選純化的產(chǎn)物用Agilent DNA 1000 chip 或Agilent high sensitive chip分析，良好的文庫應(yīng)該如圖所示，對應(yīng)的miRNA文庫條帶在147-149 bp處。
四、Small RNA建庫的常見FAQ
RT primer 能否在cDNA合成步驟添加？
不能。3'接頭連接完成后加入的RT primer與多余3'接頭反向互補形成雙鏈結(jié)構(gòu)，可以有效阻止5'接頭與3'接頭連接，從而減少接頭二聚體的形成；另外，RT primer與已連上3'接頭的RNA底物方向互補可作為逆轉(zhuǎn)錄步驟的引物，因此RT primer必須在3'接頭連接完成之后添加。
·除常規(guī)的動植物總RNA外，其他類型的總RNA是否可以作為起始模板進行文庫構(gòu)建？
除動、植物總RNA以及分離純化的Small RNA外，Vazyme ＃NR811可以兼容其他類型的總RNA，比如外泌體總RNA作為起始模板。下圖為以HeLa細胞培養(yǎng)物上清的外泌體總RNA為模板構(gòu)建的miRNA文庫（起始模板投入80ng）。
安培生物致力成為推動生命科學(xué)進步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。
可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時為客戶提供服務(wù)。
-
血清系列
-
細胞轉(zhuǎn)染
-
支原體清除
-
細胞凍存
-
實驗耗材
-
分子試劑
-
細胞增殖與凋亡
-
Biozellen系列
-
培養(yǎng)基
-
ELISA試劑盒
-
TOYOBO（東洋紡）
-
ZYMO RESEARCH
-
Greiner（格瑞納）
-
IKA（艾卡）
-
化學(xué)發(fā)光底物（ECL）
-
PROSPEC系列
-
Epigentek系列
-
微生物檢測
-
細胞生物學(xué)
-
Corning康寧
-
解離試劑
-
細胞類-實驗耗材
-
原代細胞
-
植物檢測系列試劑盒
-
SERANA
-
細胞系
-
生化試劑盒
-
環(huán)境檢測系列試劑盒（AKEN）
-
類器官培養(yǎng)
-
緩沖器和解決方案
-
生物三凝膠基質(zhì)
-
細胞因子分子
-
生物樣本庫
-
蛋白研究系列
-
修飾檢測試劑盒
