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蛋白質(zhì)互作研究方法
發(fā)布時(shí)間： 2024-02-21 點(diǎn)擊次數(shù)： 1347次相當(dāng)多的蛋白質(zhì)行使功能的時(shí)候并不是單打獨(dú)斗的，蛋白質(zhì)們通過蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合體然后進(jìn)行工作。因此，研究蛋白質(zhì)的相互作用成為研究蛋白質(zhì)功能和作用機(jī)制的最為重要的環(huán)節(jié)之一。
1.酵母雙雜交系統(tǒng)
原理：很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain,BD)與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activationdomain, AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無法完成激活功能。
將兩待測研究蛋白（蛋白X與蛋白Y）分別與BD、AD結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合質(zhì)粒。將構(gòu)建好的兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則下游基因（報(bào)告基因）不會轉(zhuǎn)錄表達(dá)；如果兩個(gè)蛋白存在相互作用，則BD與AD兩結(jié)構(gòu)域空間上很接近，從而下游基因（報(bào)告基因）得到轉(zhuǎn)錄。判斷通過報(bào)告基因表達(dá)與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。
用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體，在研究抗原和抗體相互作用、發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新功能、篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應(yīng)用廣泛。
2.免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究兩個(gè)蛋白相互作用的經(jīng)典方法。
原理：基于抗體與抗原（靶蛋白）之間的特異性結(jié)合，此時(shí)如果樣品溶液中存在能與靶蛋白相互作用的目的蛋白，會一同被拉下來，隨后利用SDS-PAGE，Western Blot等方法對得到的目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。
通俗點(diǎn)來說，假設(shè)我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用，首先我們通過合適的方法處理樣本，將蛋白提取出來（同時(shí)不能破壞蛋白之間的相互作用），然后用預(yù)先結(jié)合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白，那么與A蛋白結(jié)合的B蛋白也能一起沉淀下來。再將蛋白從珠子上裂解下來，對B蛋白進(jìn)行檢測，能檢測到，說明B蛋白在之前的沉淀過程中隨著A蛋白一起被拉下來了，進(jìn)而證明二者之間存在相互關(guān)系。
3.免疫熒光共定位
將免疫學(xué)方法（抗原抗體特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。一般用來驗(yàn)證2種或3種蛋白是否存在共定位關(guān)系。
由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。兩種不同的蛋白使用不同屬性的不同屬性的不同顏色熒光標(biāo)記后，通過觀察顏色的變化確定是否有共定位，也可以使用軟件分析。
該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。
4.Pull-down實(shí)驗(yàn)
pull-down實(shí)驗(yàn)，又稱拉下實(shí)驗(yàn)，是一種體外親和純化技術(shù)。（這個(gè)實(shí)驗(yàn)跟免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)很像，不同的是免疫共沉淀是在細(xì)胞里進(jìn)行的。）
原理：將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose）,但細(xì)胞抽提液經(jīng)過該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有被吸附的“雜質(zhì)"則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或洗脫條件而回收下來。
為了更有效地利用pull odwn技術(shù)，可以將待純化的蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)，即將“誘餌"蛋白與一種易于純化的配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘胎-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。
GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)：利用DNA重組技術(shù)將已知蛋白與GST融合，而融合蛋白通過GST與固化在載體上的GTH（谷胱甘肽）親和結(jié)合。簡單來說，我們假定a蛋白和b蛋白可能存在互作，將純化的融合GST的a蛋白和純化的b蛋白以及能特異性結(jié)合GST的Sephrose 4Bbeads混合在一起孵育一定時(shí)間，然后洗去未結(jié)合的蛋白，煮沸beads進(jìn)行SDS-PAGE電泳。通過Western blot檢測結(jié)果，我們可以看到GST-a蛋白和b蛋白所對應(yīng)的條帶，即表明了a蛋白和b蛋白因發(fā)生相互作用而被GST-a pull down(GST對照只顯示一個(gè)條帶)
pull down技術(shù)可用于驗(yàn)證已知蛋白或胎的相互作用，也可以用來篩選與已知蛋白或肽互作的未知蛋白或肽。但是在一定程度上不能真實(shí)反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用，因?yàn)樵隗w外相互作用的蛋白質(zhì)在正常生理?xiàng)l件下不一定會相互結(jié)合。
5.親和純化質(zhì)譜（AP-MS）
AP-MS（Affinity Purification coupled MS）,即親和純化串聯(lián)質(zhì)譜分析。
原理：基于特異性抗體或其他親和試劑與靶標(biāo)蛋白的親和作用，通過免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation）將靶標(biāo)蛋白與靶標(biāo)蛋白的相互作用蛋白從復(fù)雜的生物體系中純化出來，進(jìn)而進(jìn)行質(zhì)譜檢測以鑒定靶標(biāo)蛋白的相互作用蛋白。
經(jīng)典的AP-MS實(shí)驗(yàn)通常包含以下4個(gè)關(guān)鍵步驟：1）細(xì)胞或組織的裂解；2）蛋白溶液與偶聯(lián)抗體的親和微珠的孵育；3）非特異性結(jié)合和背景蛋白的清洗以及特異性互作蛋白的洗脫；4）互作蛋白的質(zhì)譜檢測和分析。
6、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)
雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC），該技術(shù)是利用熒光蛋白的特點(diǎn)來研究蛋白的相互作用。
熒光蛋白可從特定的位點(diǎn)被分開，產(chǎn)生兩個(gè)非熒光活性片段即N端片段（N-fragment）和C端片段（C-fragment）（VN及VC）。當(dāng)兩片段分別被融合到相互作用的蛋白上時(shí)，會因蛋白的相互作用力而被拉近、發(fā)生互補(bǔ)從而重新構(gòu)建成有活性的熒光蛋白并在激發(fā)光下產(chǎn)生熒光。因此利用熒光顯微鏡就可以直接通過觀察熒光有無來判斷蛋白是否發(fā)生相互作用。
這是在活細(xì)胞中觀察蛋白相互作用的很好的方法。
這個(gè)方法還是存在假陽性的，細(xì)胞里大量表達(dá)的分段的黃色熒光蛋白（YFP）可能會不受研究蛋白的結(jié)合與否而自己結(jié)合在一起，所以陰性對照的使用非常重要。
7.NanoBiT 蛋白互補(bǔ)技術(shù)
此方法與BIFC的最大區(qū)別在于，BIFC拆分的是YFP熒光蛋白，NanoBiT拆分的是螢火蟲熒光素酶 Luciferase。熒光素酶需要有底物的存在，發(fā)出的是自發(fā)熒光而非激發(fā)光 。這類技術(shù)的好處是可以在活細(xì)胞里進(jìn)行觀測，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，定量等實(shí)驗(yàn)。
該方法利用分子生物學(xué)方法將NanoBit蛋白拆分成17.6kDa的LgBit和11個(gè)氨基酸的SmBit，分別作為蛋白表達(dá)載體上面的兩個(gè)標(biāo)簽，當(dāng)兩個(gè)蛋白可以發(fā)生互作時(shí)，LgBit和SmBit空間距離拉近，結(jié)構(gòu)互補(bǔ)形成完整的NanoBit蛋白，在底物檢測下可以發(fā)出很強(qiáng)的luminescent 信號。
由于NanoBit蛋白分子量小，光信號強(qiáng)，表達(dá)效率高，非特異性自發(fā)光背景低，并且標(biāo)簽蛋白結(jié)合是可逆的，所以這個(gè)方法較BIFC有很多優(yōu)勢。
此實(shí)驗(yàn)早期需要摸索LgBit和SmBit構(gòu)建在不同的N端或C端的組合。
8.熒光共振能量轉(zhuǎn)移
熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescent Resonance Energy Transfer, FRET)是一種通過熒光物質(zhì)間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移進(jìn)行分析的光譜分析法。
當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時(shí)，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）。
青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）為目前蛋白-蛋白相互作用研究中非常廣泛應(yīng)用的FRET對。
這項(xiàng)技術(shù)不僅能驗(yàn)證蛋白質(zhì)的相互作用，還能夠表征這種相互作用距離的動態(tài)變化，比如蛋白質(zhì)分子直接相對運(yùn)動的方向速度等。
9、生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移(BRET)
用生物發(fā)光蛋白替代熒光供體，不依賴于激發(fā)光，檢測背景低。
在BRET技術(shù)中，蛋白A融合熒光素酶（通常是海腎熒光素酶），作為能量供體，蛋白B融合帶有熒光基團(tuán)的標(biāo)簽蛋白，作為能量受體，如果蛋白A、B存在相互作用時(shí)，加入熒光素酶底物后，熒光素酶發(fā)光可以激發(fā)臨近的蛋白B的熒光基團(tuán)發(fā)光，通過檢測熒光和發(fā)光信號比值，來檢測蛋白相互作用。如果蛋白A和B無相互作用，熒光素酶發(fā)光的能量將無法傳遞到受體蛋白，從而受體蛋白不會被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號。
這個(gè)方法與FRET相比，用生物發(fā)光蛋白替代熒光供體，不依賴于激發(fā)光，檢測背景低；不需要漂白，細(xì)胞損壞更少；同時(shí)也避免了自發(fā)熒光干擾；作為供體的NanoLuc螢光素酶蛋白分子量小，更適合融合蛋白表達(dá)構(gòu)建，并且光信號強(qiáng)。
但是，它需要配對的底物，并且這個(gè)底物還不便宜，需要大量使用的話要考慮好經(jīng)濟(jì)問題。
10.Duolink實(shí)驗(yàn)
Duolink實(shí)驗(yàn)基于鄰位連接技術(shù)(proximity ligation assay，PLA)，當(dāng)一對PLA probes足夠接近時(shí)(小于40 nm)會產(chǎn)生PLA信號，由于PLA probes特異識別一抗， PLA信號的強(qiáng)弱直接反映了蛋白表達(dá)量水平或蛋白互作的強(qiáng)度。
利用熒光顯微鏡可以觀察到PLA信號及其位置，通過Duolink?ImageTool 可以進(jìn)行精確的定量和表達(dá)差異等分析。Duolink實(shí)驗(yàn)?zāi)芡瑫r(shí)實(shí)現(xiàn)對蛋白-蛋白互作、蛋白表達(dá)或蛋白翻譯后修飾進(jìn)行定位、定量和檢測。
通過Duolink技術(shù)，可將蛋白信號放大1000倍，肉眼即可檢測蛋白及其互作，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)方案簡單直接。
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