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質(zhì)粒構(gòu)建的心得分享
發(fā)布時間： 2024-02-20 點(diǎn)擊次數(shù)： 1162次質(zhì)粒是我們?nèi)粘?shí)驗中比較常用的載體，其可以自主生長，也能通過比較容易的方法進(jìn)行大量擴(kuò)增，但往往單一的質(zhì)粒不能滿足實(shí)驗需求，需通過一系列方法進(jìn)行質(zhì)粒重組，我目前比較常用的方法也就是比較陳舊的酶切重組質(zhì)粒的方式，簡易實(shí)驗過程如下圖：
在這個過程中，有幾個小Tips：
1.原載體的酶切位點(diǎn)由文獻(xiàn)、載體說明書或者導(dǎo)師建議得來，選擇正確的酶切位點(diǎn)是重組質(zhì)粒開始的第一步，常見的酶切體系如下：
上述體系適用于大多數(shù)酶切，不是特別難切開的載體1μl內(nèi)切酶足夠，酶切前計算好量，先加ddH2O，最后加內(nèi)切酶。
2.酶切完成后，需要跑瓊脂糖膠鑒定酶切效果，配膠時注意選擇合適的膠濃度，原則是分子量越大，膠濃度越小。跑膠完成后紫外燈下一般會有兩段即為成功：載體和切下來的片段，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行膠回收，注意切下來的片段不回收，膠回收完成后測濃度備用。
3.插入片段根據(jù)自己的實(shí)驗選擇，通常插入片段可以通過PCR而來，或者是一段由三方公司合成的序列，在連接開始前也需要用同樣的兩個內(nèi)切酶切出缺口。常見連接體系如下：
16℃連接4h以上或過夜。 其中，加入載體和插入片段的量由說明書得來，加樣前計算好量，先加ddH2O，最后加連接酶，由于連接體系較小，一般使用pcr管進(jìn)行。
4、為確保連接的順利進(jìn)行，務(wù)必保證連接酶和連接酶緩沖液配套使用，即使用同一廠家的，不能混用。
5、上述過程中涉及到的不管是內(nèi)切酶還是連接酶，都是比較昂貴的，使用時要用冰盒，用完及時放回-20℃冰箱。 6、進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，根據(jù)載體說明書選擇合適的感受肽細(xì)胞，同時仔細(xì)閱讀感受肽細(xì)胞說明書，看清涂板體積、涂板后的培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度等。 7、挑取單克隆時，推薦至少選擇兩個及以上。 8、搖菌時，注意擰松菌管的蓋子，傾斜放入恒溫（一般為37℃）搖床，搖菌時間12-16h為宜。 9、搖菌完成后進(jìn)行質(zhì)粒提取，測濃度后送測序，注意這里會有部分說明書推薦選擇新的內(nèi)切酶酶切后跑瓊脂糖膠進(jìn)行鑒定，這也是一種鑒定方式，可以根據(jù)酶切片段的大小來判斷重組是否正確，但是，最終確定還是推薦進(jìn)行測序，因為我們無法保證在整個過程中堿基不會發(fā)生突變，可以根據(jù)上述方式選擇酶切片段大小正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序。 測序的準(zhǔn)確性對于后續(xù)慢病毒感染是非常重要的，因此測序公司的選擇十分重要，尤其出現(xiàn)一些比較難測的結(jié)構(gòu)如shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，測序技術(shù)不成熟的話會一直報重疊峰或者測不通的情況。
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深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。
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