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載體構(gòu)建及原核表達(dá)
發(fā)布時間： 2024-01-12 點(diǎn)擊次數(shù)： 1564次實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>
基因表達(dá)是生物學(xué)研究中的重要內(nèi)容之一，而基因表達(dá)載體則是基因表達(dá)研究中十分重要的工具?；虮磉_(dá)載體是一種能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)氲郊?xì)胞中并使其表達(dá)的DNA分子。在細(xì)胞內(nèi)，基因表達(dá)載體可以通過轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程將外源基因轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)原理：
表達(dá)載體是用來在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體，原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，表達(dá)載體除具有克隆載體所具有的性質(zhì)以外，還應(yīng)具有表達(dá)元件（轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的DNA序列）。
大腸桿菌表達(dá)載體要求：①有一個強(qiáng)的啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列；②應(yīng)有SD序列，且SD序列與起始密碼子ATG之間要有合適的距離；③在克隆基因與啟動子之間有正確的閱讀框架；④外源基因下游應(yīng)加入不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
構(gòu)建好表達(dá)載體之后，提取重組載體的質(zhì)粒，然后用質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)宿主菌的轉(zhuǎn)化。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.目的片段的獲取 1.1引物設(shè)計(jì)
NCBI上查找目的基因SD序列，使用Primer 5軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，在設(shè)計(jì)引物時須引入合適的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，具體可查看本公眾號分享的引物設(shè)計(jì)。
1.2 PCR擴(kuò)增（以Q5酶擴(kuò)增為例）
PCR體系（25 μl）：
2.目的片段和表達(dá)載體的連接（以T4連接為例）
PCR程序：
1.3 瓊脂糖凝膠電泳
根據(jù)目的條帶大小配置相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠，微波爐加熱，全部溶解后，冷卻至60℃左右，按照1：10000加入核酸染料，混勻后倒入凝膠鑄槽中，插入梳子，除去氣泡，待全部凝固后拔出梳子。
將凝膠置于電泳槽中，加樣孔放置于負(fù)極，進(jìn)行加樣（選取合適的DNA Marker），根據(jù)DNA Marker指示條帶在凝膠上的位置決定電泳是否終止，然后將凝膠放置在凝膠成像儀中切膠回收。
2.目的片段和表達(dá)載體的連接（以T4連接為例）
不同的表達(dá)載體具有不同的優(yōu)勢，在分析基因序列之后可以選擇最佳的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。因科研需求，需要pET系列、pGEX系列、pCold(BL21分子伴侶)系列等原核表達(dá)載體。
2.1 載體及PCR產(chǎn)物雙酶切
選擇合適的酶切位點(diǎn)，對目的片段和表達(dá)載體進(jìn)行酶切反應(yīng)。
a. 膠回收產(chǎn)物酶切：37℃ 1 h
b. 連接載體酶切：37℃ 1 h
酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，UVP觀察，用刀片切下目的條帶，參照膠回收試劑盒說明書回收目的片段。
2.2 連接反應(yīng)
將膠回收得到的酶切PCR產(chǎn)物和酶切載體進(jìn)行連接，T4 DNA ligase 16/4℃過夜，連接體系如下：
3.目的蛋白的表達(dá)
3.1 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并挑取陽性克隆質(zhì)粒
a.從-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；
b.將10μL連接產(chǎn)物全部加入到50 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min；
c.將EP管放在42℃熱激1 min 30 s，速置冰中3 min；
d.向EP管中加入440 μL無抗的液體LB，置于搖床上37℃220 rpm培養(yǎng)1 h；
e.取適量活化后菌液均勻涂布于含抗性（與載體上抗性基因一致）的固體LB培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置12-16 h；
f.轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定無誤后進(jìn)行后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
3.2 提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21
a.將鑒定正確的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞（和轉(zhuǎn)化同理）；
b.挑取單菌落接種至含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中，置于搖床上37 ℃ 220 rpm培養(yǎng)過夜；
c.將過夜培養(yǎng)的菌液以1:100的比例接種于含抗性（與載體上抗性基因一致）的液體LB培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)；
d.待OD600=0.6-0.8時，取1mL菌液作為未誘導(dǎo)全菌樣品對比，并向剩余菌液中加入終濃度為0.5 mM的IPTG，置于搖床上低溫180 rpm誘導(dǎo)過夜。
3.3 超聲破碎菌液
a.從過夜誘導(dǎo)后的菌液中取1mL作為誘導(dǎo)后全菌樣品對比，收集剩余菌液離心（8000 rpm，20 min，4℃）棄上清用PBS重懸濃縮（濃縮比例約10:1）；
b.超聲破碎（超聲4 s，停歇7 s）至透亮，結(jié)束后離心（10000 rpm，30min，4℃）分別收集上清和沉淀，將其作對照組取樣；
c.取誘導(dǎo)前全菌，誘導(dǎo)后全菌，誘導(dǎo)后上清，誘導(dǎo)后沉淀各40μL，加入10 μL 5×loading buffer，于99℃變性20min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
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