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DNA 復(fù)制需要哪些元素
發(fā)布時間： 2023-06-28 點擊次數(shù)： 1762次1) 需要脫氧核苷三磷酸：
進行 DNA 合成必須具備的 2 個關(guān)鍵底物之一，即 4 種脫氧核苷三磷酸——dGTP、dCTP、dATP、dTTP。通常商品化 PCR 酶會提供這 4 種脫氧核苷三磷酸的混合物 dNTP。2) 需要引物-模板接頭：DNA 合成的第二個重要底物是一具有特定序列的雙鏈 DNA，稱為引物-模板接頭，即指 導(dǎo)互補脫氧核苷酸添加的單鏈 DNA 模板和與模板互補但比模板短的一小段序列。較長的 DNA 鏈有一個與引物退火的區(qū)域和一個毗鄰的單鏈 DNA 區(qū)，此區(qū)作為 DNA 合成的模板；較短的引物與較長的 DNA 鏈退火，且必須有與模板單鏈 DNA 區(qū)毗鄰的游離 的 3’-OH，當(dāng)新核苷酸加入時引物的 3’-OH 端得以延伸。一般而言，引物-模板接頭的引物部分才是 DNA 合成的底物，而模板僅僅提供選擇哪種核苷酸進行添加的必要信息。因此我們在設(shè)置 PCR 反應(yīng)程序時第一步是高溫變性（一般會設(shè)置成 95℃變性），就是為了把雙鏈的模板變性成單鏈，第二步是降低溫度，是為了讓引物能互補匹配到單鏈模板上。
3) 需要 DNA 聚合酶：DNA 聚合酶的三維結(jié)構(gòu)類似于一只右手。手掌域是催化活性位點，可以催化任意 4 種脫氧核苷三磷酸的添加，這一區(qū)域結(jié)合 2 個二價金屬離子（通常是 Mg2+或 Zn2+）。其中一個 金屬離子降低 3’-OH 對其氫的親和力，這會產(chǎn)生一個準(zhǔn)備對引入 dNTP 上的 α-磷酸進行親核 攻擊的 3’O-。第二個金屬離子與 dNTP 的 β-和 γ-磷酸負(fù)電荷協(xié)同作用，穩(wěn)定由引物和引入核苷酸連接在一起時所產(chǎn)生的焦磷酸。所以我們在 PCR 時，反應(yīng)體系里加入適量的 Mg2+是十分重要的，添加的量少導(dǎo)致 PCR 酶無法發(fā)揮最大活性，添加太多則降低酶反應(yīng)的特異性。DNA 聚合酶是一種延伸酶，其催化是快速的。DNA 合成的速度主要取決于 DNA 聚合酶 的延伸能力。在實際應(yīng)用中，一般的Taq酶的延伸速度大致是擴增產(chǎn)物在2kb以內(nèi)是1kb/min。 擴增產(chǎn)物超過2kb 的部分可以以500bp/min 來計算。比如擴增2kb，延伸時間就設(shè)置成2min， 而擴增 3kb，就可以把延伸時間設(shè)置成 4min。也有延伸能力更強的酶，那么延伸時間就按產(chǎn) 品說明書描述的來設(shè)置。深圳安培生物科技有限公司，是一家具有核心的技術(shù)實力、壹流的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供壹流的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供世界前沿水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等優(yōu)質(zhì)客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。
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