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大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
發(fā)布時(shí)間： 2023-04-19 點(diǎn)擊次數(shù)： 1641次實(shí)驗(yàn)方法原理 堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線(xiàn)性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在堿性pH環(huán)境，DNA變性，當(dāng)恢復(fù)中性并在高鹽離子濃度時(shí)，絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中；而線(xiàn)性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，相互交聯(lián)纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上與蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。離心后獲得大量質(zhì)粒的上清液，利用親水性有機(jī)溶劑（乙醇、異丙醇、PEG8000）使質(zhì)粒DNA脫水，離心后收集。 實(shí)驗(yàn)材料 含質(zhì)粒的大腸桿菌試劑、試劑盒 葡萄糖 EDTA Tris-HCl NaOH SDS KAc 異戊醇儀器、耗材 臺(tái)式高速離心機(jī) 恒溫振蕩搖床 高壓滅菌鍋 振蕩器 微量移液器 1.5ml離心管實(shí)驗(yàn)步驟 一、試劑配制
1. LB液體培養(yǎng)基。
2. 100 mg/ml氨芐西林儲(chǔ)存液：稱(chēng)取25g的氨芐西林粉末，加去離子水至250ml，全部溶解后過(guò)濾、分裝，20℃保存。
3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液，25 mmoi/L Tris-鹽酸（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8 0）。1 mol/L Tris-鹽酸（pH 8.0）12.5ml，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g；加去離子水至500ml，高壓滅菌，貯存于4℃。
4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氫氧化鈉溶液，1％ SDS（10 N 氫氧化鈉20 μl，10％SDS 100μl，加去離子水至1ml），使用前臨時(shí)配制。
5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸鉀300ml，冰醋酸57.5ml，加去離子水至500ml，4℃保存。
6. 苯酚：氯仿（1：1，V／V）（酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性操作時(shí)應(yīng)戴手套?。?。
7. 無(wú)水乙醇。
8. 70％乙醇。
9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超純水溶解，然后在沸水煮
15min，分裝，20℃保存。
10. TE緩沖液：10 mmol/L Tris-鹽酸（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.O）。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液體培養(yǎng)
基中。37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約12——14h）。
2. 取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)液倒入離心管中，4℃、6000轉(zhuǎn)離心30s，棄上清，將離心管倒置于紙巾上，去除殘留液體。
3. 菌體沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻，室溫下放置5 min。
4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速溫和顛倒離心管5——10次，以混勻內(nèi)容
物，冰浴5min。
5. 加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，溫和顛倒5——10次混勻，冰浴3——5min，4℃、6000轉(zhuǎn)離心5min。轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的1.5ml Ep管中。
6. 加入等體積的酚一氯仿抽提劑，振蕩混勻，4℃、6000轉(zhuǎn)，離心2 rain。
7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中；加入2倍體積用冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇于室溫沉淀雙鏈
DNA，混勻，室溫放置2--5rain，4℃、6000轉(zhuǎn)離心5min。
8. 棄上清，將離心管倒置于紙巾上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇，蓋緊離心管顛倒數(shù)次，4℃、6000轉(zhuǎn)，離心2min。
9. 去除所有的乙醇溶液，將管倒置于紙巾上使液體流盡，室溫干燥5——10min，直到乙醇都揮發(fā)干凈。
10.將質(zhì)粒DNA沉淀溶于50 μl TE緩沖液（含20 μg/ml RNaseA）中，溫和振蕩數(shù)秒，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
注意事項(xiàng) 1. 溶液Ⅰ與溶菌液充分搖勻，用力適當(dāng)。因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌還沒(méi)有與堿和SDS作用，染色體DNA尚未釋放，不必?fù)?dān)心其分子斷裂，一般可用力振蕩幾次。 2. 加入SDS后則要注意不能過(guò)分用力振蕩，溫和混勻，但又必須讓它反應(yīng)充分。
3. 加入溶液Ⅱ混勻之后，一定要在冰上放置，不要搖動(dòng)，對(duì)于溶液Ⅲ同樣處理。
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