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砷鉬酸比色法

發(fā)布時(shí)間： 2023-01-16　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1440次

原理
還原糖是具有羰基（>C=O）的糖，能將其它物質(zhì)還原而其本身被氧化。
（1）還原糖在堿性條件及有酒石酸鉀鈉存在下加熱，可以定量地還原二價(jià)銅離子為一價(jià)銅離子，產(chǎn)生磚紅色的氧化亞銅沉淀，其本身被氧化。具體反應(yīng)如下：

（2）氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還原，還原型的鉬酸銨再與砷-酸氫二鈉起作用，生成一種藍(lán)色復(fù)合砷鉬藍(lán)，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖的含量（即被還原的Cu2O 量）成正比，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后做標(biāo)準(zhǔn)，就可測(cè)得樣品還原糖含量。
材料與儀器
植物材料
銅試劑砷鉬酸試劑標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖原液
分光光度計(jì) 具塞刻度試管水浴鍋刻度吸管容量瓶漏斗研缽
步驟
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：

在一系列刻度試管中，分別加入200μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL，再順序加入蒸餾水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 及1.4 mL，配成濃度分別為0、10、20、30、40、50 及60μg/mL 的系列葡萄糖溶液。每試管加入銅試劑2mL，混勻后沸水浴中加熱10min，立即冷卻，再加入2mL 砷鉬酸試劑，振蕩兩分鐘后稀釋到20mL,用分光光度計(jì)在620nm 波長(zhǎng)下比色，測(cè)其光密度OD620nm（做一式兩份）。以糖濃度微克數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度OD620nm 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.植物樣品中還原糖的提取：

將樣品洗凈，吸干其表面水分，切碎混勻，稱(chēng)取1g 放入研缽中，加入約0.5g 石英砂，磨成勻漿，加水將樣品由玻璃漏斗沖入100mL 容量瓶中，加水達(dá)70-80mL，搖勻后置于80℃恒溫水浴上浸提0.5h。

待上述樣品冷卻后，沉淀蛋白質(zhì)，加入5%硫酸鋅5mL，再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL，以沉淀蛋白質(zhì)。振蕩后靜置，至上層出現(xiàn)清液后再加一滴Ba(OH)2,直至無(wú)白色沉淀時(shí)，向容量瓶加水至刻度。

3.還原糖含量的測(cè)定：

過(guò)濾上述已定容的樣品液，取5mL 濾液，再定容到100mL（此步視樣品的含糖量而定）。取已稀釋的溶液2mL，與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖顯色法相同：加銅試劑2mL，煮沸10min，加砷鉬酸試劑2mL，振蕩2mL，定容到15ml，620nm 波長(zhǎng)下比色，記下光密度OD620nm（至少重復(fù)兩次）。
注意事項(xiàng)
比色皿的外面應(yīng)被擦干凈。
常見(jiàn)問(wèn)題
OD是當(dāng)光經(jīng)過(guò)一個(gè)樣本時(shí)，部分光會(huì)被吸收。在光譜學(xué)，透光率是出射光和入射光強(qiáng)度的比。

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