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T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

發(fā)布時(shí)間： 2023-01-10　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1566次

原理
T 細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到非特異性有絲分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出現(xiàn)細(xì)胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，因此可作為測(cè)定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)有形態(tài)計(jì)數(shù)法、MTT 法和同位素法三種。

MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。MTT 是一種噻唑鹽，化學(xué)名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。小鼠脾細(xì)胞受到ConA 作用后發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT 作為其底物參與反應(yīng)，形成藍(lán)色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)鹽酸─異丙醇溶解后為藍(lán)色溶液，可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD 值，測(cè)定波長(zhǎng)570 nm。根據(jù)OD 值的大小計(jì)算反應(yīng)體系中細(xì)胞增殖程度。

3H-TdR 摻入法：細(xì)胞增殖的基本條件或前提為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的復(fù)制，這是正常細(xì)胞增殖過程缺一不可的前提。一般來說，一個(gè)細(xì)胞周期可大致分為四期，即G1 期、S期、G2 期和M期。其中S期為DNA合成期，主要功能活動(dòng)為DNA合成。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（[3H-methyl]thymidine），是DNA合成的前體。加入細(xì)胞培養(yǎng)液中后被細(xì)胞攝取作為DNA合成的原料。細(xì)胞合成的DNA越多，則所摻入的3H-TdR就越多，因此，檢測(cè)所摻入的3H-TdR就可反映細(xì)胞增殖的程度。因該方法有同位素污染問題，故我們實(shí)習(xí)中仍用MTT法。
材料與儀器
ICR小鼠
RPMI1640培養(yǎng)液 Hank's液刀豆蛋白A MTT 碘酒酒精
無菌尖吸管刻度吸量管無菌解剖器械平底培養(yǎng)板 CO2培養(yǎng)箱酶標(biāo)測(cè)定儀
步驟
1. 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備

取一個(gè)滅菌的平皿，加入5 ml Hank's液。頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，放入平皿中，在鋼網(wǎng)上研磨并過篩，制成細(xì)胞懸液。取出100 μl用于計(jì)數(shù)。將其余細(xì)胞懸液移入一離心管中，離心1500 rpm，7 min，（或1000 rpm，10 min）棄去上清，用RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋，制成2.5×106 /ml的脾細(xì)胞懸液，然后加入ConA使每孔最終濃度為2 μg/ml，同時(shí)做不加ConA的陰性對(duì)照孔。
2. 將上述細(xì)胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中，每孔0.1 ml。

3. 將培養(yǎng)板放入含有5 %CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72 小時(shí)，在培養(yǎng)結(jié)束前4-6 小時(shí)，于培養(yǎng)板各孔內(nèi)加入1 mg/mlMTT液，10 μl/孔。37 ℃培養(yǎng)6 小時(shí)。
4. 各孔內(nèi)加入0.01 M 鹽酸—異丙醇110 μl，30 分鐘內(nèi)（或加2 %SDS100 ul/孔，過夜）用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)OD 值，測(cè)定波長(zhǎng)570 nm。
注意事項(xiàng)
1. 由于本實(shí)驗(yàn)需要培養(yǎng)3 天，才能觀察結(jié)果。因此，在操作時(shí)應(yīng)注意無菌操作，避免細(xì)菌污染，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。

2. 細(xì)胞操作要輕柔、迅速，以免細(xì)胞損傷影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

常見問題
一、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組三個(gè)復(fù)孔的 OD 值平均。

轉(zhuǎn)化值=實(shí)驗(yàn)組的平均OD 值-對(duì)照組的平均OD 值。

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