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大鼠肝細(xì)胞分離實驗
發(fā)布時間： 2022-12-05 點擊次數(shù)： 1400次原理
經(jīng)肝門靜脈或肝門靜脈分支插管，用無鈣緩沖液灌洗肝 15 min，再用酶溶液灌洗 15 min。收集和洗滌細(xì)胞，計數(shù)有活力的肝細(xì)胞。
材料與儀器
L-15 Leibovitz 培養(yǎng)液 Ham F12 培養(yǎng)液 胞培養(yǎng)液 HMM SF 無鈣 HEPES 緩沖液 膠原蛋白酶液 5% 戊芭比妥鈉 肝素
聚乙稀管 一次性 20 G 頭皮靜脈輸液針 縫合線 l 注射器 水浴箱 蝠動泵步驟
一、材料
1. 無菌
（1）L-15 Leibovitz 培養(yǎng)液
（2）Ham F12 培養(yǎng)液或 WilliamE 培養(yǎng)液：80～100 ml，含有 0.2% 牛白蛋白（V 級，Sigma) 和 1 ug/ml 牛胰島素
（3）胞培養(yǎng)液（hepatocyte minimalmediu，HMM )：67.5% EMEM 和 22.5%199 培養(yǎng)液，或用 William E 培養(yǎng)液代替這兩種培養(yǎng)液。添加 5ug/ml 牛胰島素、lmg/ml BSA、20 mmol/L 丙酮酸鈉、100U/ml 青霉素、100 Mg/ml 鏈霉素和 20%FBS
（4）HMM/SF：無血清 HMM ，添加 10-5mol/L 氫化可的（木公）半琥珀酸酯
（5）無鈣 HEPES 緩沖液：含有 160.8 mmol/L NaCl、3.15 mmol/L KCl、0.7 mmol/L Na2 HPO4·12 H2O 和 33 mmol/L HEPES，pH 7.65。用 0.22, 又微孔濾器過濾除菌，在 4℃ 條件下儲存，可存放 2 個月
（6）膠原蛋白酶液：含有 0.025% 膠原蛋白酶（I 級，Sigma; 或 Boche，103578) 和 0.075% CaCl2·2 H2O，用 pH 7.65 的無鈣 HEPES 緩沖液配制。使用前配制，并用濾器過濾除菌
（7）5% 戊芭比妥鈉（Abbott)
（8）肝素（Roche)
（9）聚乙稀管：內(nèi)徑為 3 mm ，外徑 5 mm
（10）一次性 20 G 頭皮靜脈輸液針（Dubernard Hospital Laboratory，Bordeaux，F(xiàn)rance)
（11）插管用的縫合線
（12）刻度瓶和 Petri 培養(yǎng)皿
（13）手術(shù)器械：尖剪、直剪、彎剪和手術(shù)夾
（14）2 支二次性 1 ml 注射器
2. 非滅菌
（1）計時器
（2）蝠動泵：10～200r/min
（3）水浴箱
二、操作步驟
1. 用水浴箱將 HEPES 緩沖洗液和膠原蛋白酶液預(yù)熱，一般 38～39℃，進人肝內(nèi)時為 37℃。不需要加氧。
2. 將螺動架的流速設(shè)定在 30 ml/min。
3. 腹膜腔注射戊芭比妥鈉（每 100 g 體重注射 150ul)，將大鼠（180～200 g ) 麻醉。然后，經(jīng)股靜脈注射 10001U 肝索。
4. 用 70% 乙醇擦洗大鼠腹側(cè)面。
5. 切開腹壁，在離肝約 5 mm 處將結(jié)扎線系于肝門靜脈上。朝肝的方向插管后，結(jié)扎肝門靜脈。
6. 為了避免壓力過高，迅速剪開肝靜脈。以流速 30 ml/min 灌注 500 ml 無鈣 HEPES 緩沖液。幾秒鐘內(nèi)確認(rèn)肝變白。
7. 以流速 15 ml/min 灌注 300 ml 膠原蛋白酶液。肝變得腫脹。
8. 切除肝，用 HEPES 緩沖液沖洗。
9. 剝離 Glisson 囊后，用 100 ml L-15 Leibovitz 培養(yǎng)液分散細(xì)胞。
10. 用兩層紗布或孔徑為 60～80um 的尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液。通常在室溫條件下，讓有活力的細(xì)胞沉淀 20 min 。然后，吸去 60 ml 含有細(xì)胞碎片和死細(xì)胞的上清液。
11. 通過緩慢離心（50 g，40s) 洗細(xì)胞 3 次，以除去膠原蛋白酶、損傷細(xì)胞和非實質(zhì)性細(xì)胞。
12. 用 HMM 混懸分離的肝細(xì)胞。
13.2～3 h 后，活細(xì)胞會貼壁，并開始伸展。吸去含有死細(xì)胞的上清液。
14. 細(xì)胞貼壁后，用 HMM/SF 替代含有 FBS 的 HMM。此后，每天換培養(yǎng)液。以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
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安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)
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