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蛋白質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間： 2022-12-01 點(diǎn)擊次數(shù)： 1657次簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)分離的方法主要有 3 種：SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)、免疫沉淀法分離蛋白質(zhì)和雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)。
原理
SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)的基本原理是蛋白質(zhì)在 SDS 和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵打開(kāi)，形成帶負(fù)電荷的 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，聚丙烯酰胺（PAGE）是一種具有三維結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀高分子聚合物，具有分子篩的作用。蛋白質(zhì)在 PAGE 電泳中向正極遷移，遷移速率取決于分子的大小、電荷及其空間結(jié)構(gòu)。SDS 帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷，不同的蛋白質(zhì)與之結(jié)合后具有相同的荷質(zhì)比，并具有相似的空間構(gòu)象，使得 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在 PAGE 中的遷移速率只與蛋白質(zhì)的分子大小相關(guān)。免疫沉淀法分離蛋白質(zhì)的基本原理是是利用特異的抗體從細(xì)胞裂解物中分離目的蛋白的一種沉淀方法。該方法首先要制備細(xì)胞裂解液，然后將特異性抗體加到細(xì)胞裂解液中，4 ℃ 下孵育一定時(shí)間后，再加入可以與特異性抗體結(jié)合的固相化分子使之形成不溶性抗原-抗體復(fù)合物而沉淀。將沉淀下來(lái)的抗原-抗體復(fù)合物在含有 SDS 和 DTT 的緩沖液中加熱后，使被沉淀的抗原釋放出來(lái)，經(jīng)電泳分離后即可用各種方法檢測(cè)。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個(gè)一級(jí)屬性-等電點(diǎn)和分子質(zhì)量的特異性，將蛋白質(zhì)混合物在電荷（等電聚焦，IEF）和分子質(zhì)量（變性聚丙烯酰胺凝胺電泳，SDS-PAGE）兩個(gè)水平上進(jìn)行分離。2D-PAGE 的第一向電泳是等電聚焦電泳（IEF），蛋白質(zhì)因所帶凈電荷的不同而被分離開(kāi)；然后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行第二向電泳-SDS-PAGE，在 SDS-PAGE 中，不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)相互間分離開(kāi)。由于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和所帶凈電荷是兩個(gè)彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)，而 2D-PAGE 同時(shí)利用了蛋白質(zhì)間在這兩個(gè)性質(zhì)上的差異分離蛋白質(zhì)。
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