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如何才能把細胞培養(yǎng)好？
發(fā)布時間： 2022-11-01 點擊次數(shù)： 2442次一、細胞培養(yǎng)的基本概念
（1）基本概念
細胞培養(yǎng)：狹義的細胞培養(yǎng)主要是指分離（散）細胞培養(yǎng)，廣義的細胞培養(yǎng)還包括單（個）細胞培養(yǎng)又稱克?。╟lone），是指單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。
原代培養(yǎng)：即第一次培養(yǎng)，指將培養(yǎng)物放在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。
傳代：原代培養(yǎng)成功后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面因營養(yǎng)物不足和代謝物積累不利于生長或發(fā)生中毒。需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進行培養(yǎng)。這個過程稱為傳代或者再培養(yǎng)。
細胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首傳代成功后，即成細胞系。如細胞系不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，稱為有限細胞系，它由原代培養(yǎng)中的許多細胞系列組成。如細胞系可連續(xù)傳代，則稱為連續(xù)細胞系，即已建成的細胞系。
細胞株：通過篩選或克隆化，且有特殊性質(zhì)或特異標記的細胞。這些特性在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。這些特性包括具有一定的標記染色體，對某種病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。
二、細胞的生長
（1）生長方式
貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。
懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。
（2）生長過程
游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10min-4h。
貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞株平均在10min-4h貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團）。
潛伏期：此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期般為6~24小時。
對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最為適合進行實驗研究。
停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂，機制：接觸抑制、密度依賴性。
（3）生長條件
細胞的營養(yǎng)需，細胞的生存環(huán)境，溫度：37℃，O2，CO2：5%，pH：7.2-7.4，滲透壓，無污染，無毒。
三、常用的器材與試劑
（1）常用儀器
超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境。紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。
濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。
電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2h）。主要用干玻璃器皿消毒。
壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣。
CO2培養(yǎng)箱:CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件:37℃，5%CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題：
①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。
②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h）。
③箱內(nèi)火菌蒸餾水 3000ml 蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。
其它儀器：倒置顯微鏡，酶標儀，微孔板震蕩器，液氮罐，自動雙重純水蒸餾器，純水儀等。
（2）常用耗材
耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，培養(yǎng)板，凍存管，酒精燈
（3）常用試劑
消化液
胰蛋白酶：是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，常用的胰蛋白酶液濃度是0.25%。用濾器過濾除菌，如經(jīng)費充裕可以直接購買已經(jīng)配制好的胰酶，無需自己配制。
胰蛋白酶作用機制：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。
胰蛋白酶液消化時間：2-10 min?？捎煤迮囵B(yǎng)液終止其對細胞的消化作用。
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）：是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。
天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。
合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低。缺點：缺少某些成分，不能全滿足體外細胞生長需要，只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。
血清培養(yǎng)基
血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分。
常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量為好。
血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵，優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30min。血清的消毒：過濾除菌。
抗菌素的使用
抗生素的作用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素最終使用濃度為每毫升100單位，方便、廣譜、穩(wěn)定。
完培的組成
基礎(chǔ)培養(yǎng)基80%一95%，血清5%-20%，碳酸氫鈉2.0g/L，青、鏈霉素各100單位/毫升。
四、細胞的傳代方式
（1）懸浮細胞
直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。
離心法傳代：離心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。
（2）半懸浮細胞
此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。
（3）貼壁細胞
采用酶消化法傳代，常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。
詳細步驟:
1、吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入1-2ml PBS清洗2-3遍，吸出PBS。
2、加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液，以消化液能覆蓋整個瓶底為準。
3、靜置2-10min（具體時間根據(jù)細胞狀態(tài)確定），顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測，當(dāng)細胞消化全，立即加入含血清培養(yǎng)基，終止消化。
4、轉(zhuǎn)移至離心管，離心（800r/min，5min）。
5、吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細胞沉淀，混勻，形成細胞懸液。
6、吸取適量細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。
7、加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
五、細胞的凍存與復(fù)蘇
（1）凍存和復(fù)蘇的原則
慢凍快融，當(dāng)細胞冷到0℃以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
（2）慢凍程序
方法一：當(dāng)溫度在-25℃以上時，-1~-2℃/min；當(dāng)溫度達-25℃以下時，-5~-10℃/min；當(dāng)溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中細胞凍存。
方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機中每分鐘降-1～-3℃至-80℃以下，再放入液氮長期保存。
方法三：購買無血清快速細胞凍存液，可以省掉程序降溫的步驟，直接凍存。補充：一般凍存液的配置：90%血清+10%DMSO。
（3）基低溫保護劑的應(yīng)用
在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。
（4）細胞凍存步驟
1、預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基10%DMSO
2、取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成細胞懸液（1×106~5×106細胞/ml）
3、加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。
4、按照慢凍程序?qū)毎M行凍存。
（5）細胞復(fù)蘇步驟
1、從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴鍋，使其融化（1分鐘左右）。
2、立即轉(zhuǎn)移至離心管，加入適量培養(yǎng)液。
3、以800r/min離心5分鐘。
4、去上清，加新鮮培養(yǎng)液，吹打混勻成細胞懸液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
六、細胞計數(shù)
（1）人工計數(shù)法
吹打待測細胞懸液中細胞，使其在懸液內(nèi)分布均勻，這樣只需測定很小一部分體積的細胞懸液中的細胞數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。
酒精消毒計數(shù)板：用酒精棉將細胞計數(shù)板和蓋玻片全擦拭干凈，并將蓋玻片蓋于細胞計數(shù)板上；
轉(zhuǎn)移蓋玻片：吸取10 ul單細胞懸液，并沿著蓋玻片邊緣滴加，使細胞懸液填滿蓋玻片和計數(shù)板之間區(qū)域，注意避免產(chǎn)生氣泡，細胞懸液亦不能流入計數(shù)板的邊槽中，之后靜置3 min；
數(shù)細胞：隨機選取計數(shù)板上其中4大格并記錄4大格中的細胞總數(shù)，壓線的細胞按照數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則，之后按照以下公式進行計算：
細胞數(shù)／mL=4大格細胞總數(shù)／4×104×稀釋倍數(shù)
七、注意事項
（1）注意事項
計數(shù)前：計數(shù)前，注意吸盡培養(yǎng)皿里的細胞，充分混勻，使細胞分散成單個細胞。
實驗操作臺：實驗操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。
吸管：吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。
手：不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內(nèi)部，吸管前部等所有可能與細胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。
火焰滅菌時間：開啟、關(guān)閉長有細胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。
換液：換液時傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。
吹打細胞：吹打細胞時，要注意邊角的細胞是否吹打下來。
相對較臟的物品:手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。
交叉污染:每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。
自身的安全:注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應(yīng)特別小心。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。
凍存:從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。
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