細(xì)胞增殖實驗操作
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科研小白入門必修之MTT實驗操作總結(jié)
發(fā)布時間： 2022-06-08 點擊次數(shù)： 4145次MTT實驗也叫細(xì)胞存活分析實驗，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶(SDH)和細(xì)胞色素-C的作用下四氮唑環(huán)會開裂，生成紫色的甲?結(jié)晶，利用DMSO將甲?溶解出來之后，再利用吸光度的測定去評估有多少細(xì)胞存活。
1.接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000－10000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積180ul-200ul.
2.培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，正常培養(yǎng)2-3天也可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間。
3.顯色：每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。
4.比色：選擇480nm-570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
細(xì)胞增殖實驗結(jié)果計算
以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線或計算細(xì)胞生長抑制率、細(xì)胞相對增殖率等。
前方高能，MTT實驗預(yù)警
1.細(xì)胞消化。若消化出現(xiàn)問題，則會影響細(xì)胞的活性，進(jìn)而影響 OD 值。對于 MCF-7、BT474等一系列容易消化的細(xì)胞，消化時胰蛋白酶中不添加 EDTA，只需胰酶浸潤數(shù)秒即可。然而，對于caco-2等一系列難以消化的細(xì)胞，胰蛋白酶中可添加濃度為 0.25% 的 EDTA。
2.選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。
3. 結(jié)晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內(nèi)孵育 10～20 min，這樣有助于 DMSO對紫色結(jié)晶物的溶解（尤其在冬天）。
4..避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗。在顯色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液，棄去培養(yǎng)液時，吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內(nèi)側(cè)壁吸取，不要觸碰底部的紫色結(jié)晶；或者將96孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液。
5.設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。每組設(shè)定3復(fù)孔。
6.MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。
7.酶聯(lián)免疫檢測儀使用前應(yīng)打開電源預(yù)熱半小時。
8.選擇不同的波長，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測靈敏度不同。應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)的波長。
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