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氨基酸代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

發(fā)布時(shí)間： 2022-03-10　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1742次

原理
在含有放射性標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中，短期培養(yǎng)細(xì)胞（<30min）對蛋白質(zhì)進(jìn)行脈沖標(biāo)記。

材料與儀器
37℃ 細(xì)胞懸液 [35S]標(biāo)記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標(biāo)記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
PBS(冷凍) 37℃ 脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基
配有液體同位素垃圾閥門的真空吸氣器

步驟
1. 室溫融化 [35S] 標(biāo)記甲硫氨酸，并用預(yù)熱的（37℃）脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。

2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~2 × 107 細(xì)胞。用 10 ml 預(yù)熱的脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基洗細(xì)胞。室溫下 300 g 離心 5 min, 吸棄上清。輕柔敲打試管底部使細(xì)胞重懸并再洗一次。

3. 用預(yù)熱脈沖標(biāo)記的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使其濃度為 5 × 106/ml。在 37℃ 水浴中溫育 15 min 以去掉細(xì)胞內(nèi)的甲硫氨酸。定時(shí)顛倒試管來使細(xì)胞重懸。

4. 室溫下 300 g 離心 5 min，吸棄上清。用 2 ml [35S] 標(biāo)記甲硫氨酸的工作溶液（見步驟 1）重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至干凈 15 ml 離心管中。蓋緊蓋子。在 37℃ 水浴中溫育 10~30 min, 不時(shí)輕柔顛倒試管或振蕩使細(xì)胞重懸。

5. 4℃、300 g 離心 5 min，吸棄上清。用 10 ml 冰預(yù)冷的 PBS 輕柔重懸并再次離心。

6. 可選：通過三氯乙（yi）酸（TCA）沉淀來測定標(biāo)記物的摻入量（見輔助方案）。

7. 如果細(xì)胞沉淀不馬上使用的話，可以置于冰上幾小時(shí)或 80℃ 保存幾天。分析前冰上融化細(xì)胞沉淀。

注意事項(xiàng)
1. 在標(biāo)記過程中，揮發(fā)性的含有[35S]標(biāo)記的化合物可能會(huì)釋放，含有[35S]標(biāo)記甲硫氨酸的培養(yǎng)基應(yīng)保存在密閉緊蓋的試管中，用前置于37°C水浴。在37°C不能超過60 min。
2. 在大多數(shù)情況下，冷凍細(xì)胞不會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物化學(xué)特性，但是在用去污劑溶解后再凍融細(xì)胞抽提物可引起多亞單位復(fù)合物的解離或標(biāo)記蛋白質(zhì)降解。

常見問題
1. 實(shí)驗(yàn)材料中的細(xì)胞懸液可以選擇如 Jurkat、RBL、K562、BW5147、T 和 B 細(xì)胞雜交瘤等，要求是生長于潮濕、37℃、5% 032溫箱中或從組織中制備（如淋巴細(xì)胞）。
2. 脈沖標(biāo)記不會(huì)使培養(yǎng)基中的標(biāo)記物*喪失，因此標(biāo)記混合物可以重復(fù)使用。收集標(biāo)記的培養(yǎng) 基，小心地用0.45 μm的濾器濾過。細(xì)胞標(biāo)記前后通過閃爍記數(shù)標(biāo)記混合物來估計(jì)未摻人放射活性的百分比。-20°C冷凍條件下標(biāo)記的混合物可以保存2個(gè)月。

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