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SD大鼠骨髓間質(zhì)干細胞培養(yǎng)方法技巧

發(fā)布時間： 2022-01-15　　點擊次數(shù)： 2274次

SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞簡單介紹：
骨髓原始間充質(zhì)干細胞(SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞)是骨髓基質(zhì)干細胞，是人們在哺乳動物的骨髓基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細胞的多種分化潛能的細胞亞群。它們對骨髓中的造血干細胞（HSC）不僅有機械支持作用，還能分泌多種生長因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來支持造血。
　常用的分離MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度離心法，(SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞)全骨髓法即根據(jù)干細胞在低血清培養(yǎng)基中有貼壁優(yōu)勢特性，定期換液除去不貼壁細胞，從而達到純化及擴增MSC的目的。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中各細胞成分比重的不同，分離單核細胞進行貼壁培養(yǎng)。二者本質(zhì)上無多大區(qū)別。隨著對MSC表面抗原認識的深入，又有人利用免疫方法如流式細胞儀法、免疫磁珠法等對其進行分離純化。但經(jīng)過流式或磁珠分選后的細胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問題，加之成本較高和技術(shù)的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。

常見分離方法

目前BMSCs的分離方法主要有:
? 貼壁分離法：根據(jù)BMSCs的粘附特性來實現(xiàn)分離貼壁的方法；
? 密度梯度離心法：根據(jù)BMSCs與其他細胞的密度不同來分離的方法；
? 流式細胞儀分離法：根據(jù)細胞大小或者根據(jù)細胞表面的一些特殊標志來分離的方法。

密度梯度離心法與流失細胞儀分離法價格昂貴且操作復(fù)雜、容易導(dǎo)致細胞大量流失，應(yīng)用相對較少。貼壁培養(yǎng)法應(yīng)用最早，具有操作簡單，對細胞干擾少，不易發(fā)生污染等特點較為廣泛應(yīng)用，其缺點是細胞純度較低，但有關(guān)研究表明，BMSCs細胞擴增到P1、P2代后細胞的純度分別可達到95%、98%。

大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞細胞傳代能力測試
大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生長快速，高密度會影響細胞干性，建議按照1:3比例傳代細胞，傳代建議使用胰酶濃度為0.05%進行消化。消化每t25培養(yǎng)瓶加胰酶1ml。消化時間約1-2min內(nèi)，t25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)液約7ml*培養(yǎng)基。
本次驗證：傳代圖如下（4X）
P1-P5代，按照1:3比例傳代，48H(隔天)傳代一次。每次細胞狀態(tài)和增殖能力均良好。
P6-p8代1:3傳代，72h（隔兩天）傳代一次。
P8-P10代1:3傳代，144h（隔6三天）傳代一次。
此時細胞個體變大，生長速度明顯減慢。

細胞形態(tài)圖：
細胞處于快速分裂的狀態(tài)，良好的MSCs顯示較小的紡錘狀的形態(tài)，伴有較多的折光的雙聯(lián)體，為新的正在分裂的細胞。細胞首代狀態(tài)較好，多數(shù)呈長梭形生長，部分不規(guī)則，極性良好，經(jīng)傳代 5次后，細胞仍較有活力。以1:2 的分種率傳代，約48h可長滿。

分化測試
1. 成脂誘導(dǎo)分化
細胞匯合度約達 80%時，加入間質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)液后，細胞回縮較明顯。11 天后已有大量脂滴出現(xiàn)，培養(yǎng)21天后進行油紅O 染色，可見被染為紅色的較標準的脂滴。
油紅O染色試劑盒描述：
油紅O是一種脂溶性重氮染料，用于染色細胞和組織中的脂質(zhì)和脂肪沉積物。雖然樣品可能是新鮮的，冷凍的或福爾馬林固定的，但油紅O與石蠟包埋的組織切片不相容。觀察油紅O沉淀是正常的。因此，必須使用Whatman紙或注射器驅(qū)動的過濾器單元通過過濾新鮮制備工作溶液。

2.成骨誘導(dǎo)分化
細胞匯合度約達 70%時，加入間質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo) 21 天可見鈣結(jié)質(zhì)，進行茜素紅染色鑒定，茜素紅與類骨質(zhì)結(jié)合，形成同心圓狀的深紅色小結(jié)節(jié)。
茜素紅S染色試劑盒描述：
茜素紅S （Alizarin Red S,簡稱ARS ）作為一種染料型配位劑在分光光度分析方面已有了廣泛的應(yīng)用。近年來，很多作者把 ARS 及其金屬配位物在汞電極上的吸附催化波用于電分析中，提高了測定的靈敏度和選擇性。

3.成軟骨細胞分化
細胞匯合度約達 70%時，加入間質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo) 21 d 后，使用甲苯胺藍染色可見較廣泛的細胞外基質(zhì)藍紫色，尤其在細胞堆積區(qū)，圖中為細胞密度稍低的區(qū)域也可見明顯的異染顆粒。

阿利新藍染色試劑盒描述：
  阿爾辛藍是一種用于檢測細胞軟骨形成的染料，它可以染色軟骨組織中的硫酸化蛋白多糖。阿爾辛藍染色試劑盒含有1%的阿爾辛藍溶液，0.1%的核固紅，方便，即用型溶液。在pH 2.5時，阿爾辛藍染色酸性粘多糖并顯示藍色，而核固紅染色核粉紅色至紅色，細胞質(zhì)淡粉紅色。

表面分子流式檢測
CD29:來源 THermoFisher      PE
CD90:來源 THermoFisher      PE
CD45:來源 THermoFisher     FITC

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