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細(xì)胞誘導(dǎo)與檢測(cè)方法

發(fā)布時(shí)間： 2022-01-10　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2351次

使用細(xì)胞細(xì)胞包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)板，將傳代或復(fù)蘇凍存的人間充質(zhì)干細(xì)胞接種到6孔板上，密度為2×105 -3×105 cells/cm2或2×105 -3×105 cells/孔，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，小心的將孔內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉，向6孔板中加入2mL人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基,以此記為第0天。

一、細(xì)胞誘導(dǎo)前可使用多聚賴氨酸溶液進(jìn)行細(xì)胞包被，以便細(xì)胞更好的進(jìn)行貼壁。

二、每隔1-2天更換新鮮的人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基；
注意：為防止脂肪細(xì)胞脫落，建議誘導(dǎo)過程中出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞結(jié)節(jié)之后，換液形式變?yōu)槊刻煲淮伟肓繐Q液。

三、誘導(dǎo)14-21天期間，視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況進(jìn)行染色。

以下是總結(jié)的染色方法

脂肪油紅染色，有的是動(dòng)物/人體脂肪組織切片，或細(xì)胞爬片。各有操作稍有差異。

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*成熟飽滿的脂肪細(xì)胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以壓片，切片都要考慮到這個(gè)問題。

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五

細(xì)胞爬片細(xì)胞溶液脫落，特別是脂滴大的。操作務(wù)必要輕柔。不要把細(xì)胞沖掉。

一
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三
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五

如果做脂肪組織冰凍切片，冰凍切片要適當(dāng)厚一些，一般為10-15µm，切片太薄容易導(dǎo)致脂肪流失

一
二
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五

如果培養(yǎng)載體為塑料制品，hoechst33342染核的話，塑料板自發(fā)熒光也為藍(lán)色，必須考慮波長(zhǎng)，激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)=485nm/572nm

一
二
三
四
五

染色步驟：
（1）先小心輕緩倒去培養(yǎng)液。
（2）用pbs輕緩漂洗。
（3）加10%中性甲醛或者95%以上的酒精固定30min以上
（4）稀釋改良型即用油紅染色試劑盒，油紅：PBS＝3:2，室溫放置10min
（5）染色10-20min左右，加的體積覆蓋住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml。
（6）脫色，用75%酒精/60%異丙醇漂洗，除去多余的染料
（7）復(fù)染，淡蘇木染色1/5分鐘，pbs漂洗（這一步不做也可，看試驗(yàn)需要，并且蘇木素會(huì)把胞漿染紅，如要顯示核， hoechst33342也可以，濃度5微克/毫升染10分鐘即可把核染上）。
（8）甘油明膠封片（封片后可長(zhǎng)期保存）。
（9）若不用明膠封片，請(qǐng)盡快拍照。

油紅O染色試劑盒在傳代培養(yǎng)中，接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時(shí)，間質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯提高，而誘導(dǎo)細(xì)胞分化時(shí)則需要較高的細(xì)胞密度，這可能與分化時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。而在培養(yǎng)過程中，若細(xì)胞過度融合會(huì)促進(jìn)其分化趨向，故要保持干細(xì)胞未分化狀態(tài)，要及時(shí)傳代。

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