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從96孔微培養(yǎng)板生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離DNA
發(fā)布時(shí)間： 2021-12-20 點(diǎn)擊次數(shù)： 1366次原理
本方案由 Ramirez-solis 等的方法 1992，1993 改進(jìn)而成，是一種從微培養(yǎng)板的每個(gè)孔生長(zhǎng)的真核細(xì)胞抽提基因組 DNA 的簡(jiǎn)便有效的方法。每個(gè)孔產(chǎn)生的基因組 DNA 足以做數(shù)次聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 或者一次 Southern 雜交。對(duì)于制備用于 PCR 反應(yīng)的基因組 DNA 的最佳方法。
材料與儀器
限制性內(nèi)切核酸酶 無(wú) DNase 的 RNase 細(xì)胞
細(xì)胞裂解緩沖液 乙醇 NaCl 乙醇溶液 磷酸鹽緩沖液 蔗糖凝膠上樣緩沖液 TE
抽氣設(shè)備 多通道移液器 溫箱 振搖平臺(tái) Tupperware 容器步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
細(xì)胞裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，10 mmol/L NaCl，0.5% (m/V) Sarkosyl）
乙醇
NaCl/乙醇溶液
磷酸鹽緩沖液（PBS )
蔗糖凝膠上樣緩沖液
TE (pH 8.0)
2. 酶和緩沖液
限制性內(nèi)切核酸酶
無(wú) DNase 的 RNase
3. 專用設(shè)備
與帶閥門的真空管相連的抽氣設(shè)備
多通道移液器，8 或 12 道
溫箱，預(yù)設(shè)至 60℃。
振搖平臺(tái)
Tupperware 容器
4. 細(xì)胞和組織
在 96 孔微培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的細(xì)胞
二、方法
1. 用藍(lán)色尖頭或者巴斯德移液管吸去 96 孔培養(yǎng)板每個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液。
只要小心不接觸細(xì)胞層，通常不用毎個(gè)培養(yǎng)孔換新的尖頭。
2. 每個(gè)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞用 100 μl 磷酸鹽緩沖液沖洗 2 次。
3. 用多通道移液器在微培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入 50 μl 細(xì)胞裂解液。將數(shù)張濕的吸水紙置入一個(gè)聚丙烯盒中（如 Tupperware 盒)，再將盛有細(xì)胞裂解液和細(xì)胞的微培養(yǎng)板放在吸水紙上，用蓋封嚴(yán)盒子。
4. 將封好的盒子在 60℃ 溫箱中溫育 12~16 h。
5. 將盒子移出溫箱，取出培養(yǎng)板平放在工作臺(tái)上，冷卻數(shù)分鐘，每孔加入 100 μl NaCl/乙醇溶液。不用混勻，直接將培養(yǎng)板于室溫溫育 30 min。溫育末期應(yīng)見(jiàn)到纖維狀的核酸沉淀。
6. 緩慢地倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，將乙醇溶液倒入水池。核酸沉淀應(yīng)黏附在培養(yǎng)孔的底部。將每個(gè)培養(yǎng)板倒置于干燥的吸水紙上，使殘余乙醇從培養(yǎng)板流出。
7. 每孔加入 150 μl 70% 乙醇，小心不要移動(dòng)核酸沉淀。按步驟 6 倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)板以去除 70% 乙醇。在吸水紙吸去多余的液體。用 70% 乙醇再?zèng)_洗沉淀 2 次。
8. 使培養(yǎng)板在室溫干燥直至最后的乙醇揮發(fā)。如果基因組 DNA 將用于 PCR 分析，進(jìn)行步驟 9。如果 DNA 將用于 Southern 雜交，進(jìn)行步驟 10、11 和 12。
9. 每孔加入 30~50 μl TE ( pH 8.0), 室溫緩和地震搖 12~16 h 使 DNA 溶解。
10. 如果 DNA 將用于 Southern 雜交，制備下列限制性內(nèi)切核酸酶混合物；每孔需 40 μl。
H2O 0.8倍體積
10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液 0.1倍體積
無(wú) DNase 的 RNase 10 μg/ml
使用前每 40 μl 混合物加入 10 個(gè)單位限制性內(nèi)切核酸酶。
11. 用多通道移液器在每個(gè)孔中加入 40 μl 限制性內(nèi)切核酸酶反應(yīng)混合物。反復(fù)抽吸數(shù)次使孔中內(nèi)容物混合，小心避免產(chǎn)生氣泡。按步驟 3 用 Tupperware 容器制作濕盒, 將培養(yǎng)板放入，使反應(yīng)在適宜的消化溫度溫育 12~16 h。
12. 加入 5~10 μl 蔗糖凝膠上樣緩沖液終止反應(yīng)，進(jìn)行 Southern 印跡和雜交以分析消化的 DNA。以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物科技有限公司介紹：
安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。
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