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BAL31 核酸酶消化法產(chǎn)生雙向缺失突變體實驗
發(fā)布時間： 2021-12-16 點擊次數(shù)： 1524次材料與儀器
BAL31 緩沖液 EGTA 乙醇酚 氯仿 醋酸鈉 蔗糖凝膠上樣緩沖液 TE 噬菌體 T4DNA 聚合酶 BAL31 核酸酶 大腸桿菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段 限制性內(nèi)切酶 瓊脂糖凝膠 用于凝膠電泳的 DNA 分子量標準
計時鐘 水浴步驟
材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1, 將貯存液稀釋到合適的濃度。
5XBAL31 緩沖液
2.5mol/LNaCl
62.5 mmol/LCaCl2
62.5 mmol/LMgCl2
100 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
有 4 種 dNTP 的溶液，每種濃度為 0.5 mmol/L
EGTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
醋酸鈉（3mol/L，pH5.2)
蔗糖凝膠上樣緩沖液
TE(pH7.6)
酶和緩沖液
噬菌體 T4DNA 聚合酶
BAL31 核酸酶
大腸桿菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段
限制性內(nèi)切酶
請見步驟 3、23 和 31。
凝膠
瓊脂糖凝膠
請見步驟 3 和 32。
含 0.5ug/ml 溴化乙錠的瓊脂糖凝膠（0.8%)
請見步驟 11。
用 TBE 配制的含 0.5ug/ml 溴化乙錠的瓊脂糖凝膠
請見歩驟 25。
制備瓊脂糖凝膠
請見步驟 27。
核酸和寡核苷酸
用于凝膠電泳的 DNA 分子量標準
專用設(shè)備
計時鐘
65°C 水浴和適合限制性內(nèi)切核酸酶消化溫度的水浴
其他試劑
本方案步驟 1 需要的試劑列在第 1 章方案 17~19 或第 3 章方案 6 中。
本方案步驟 2 需要的試劑列在第 1 章方案 9 中。
本方案步驟 27 需要的試劑列在第 5 章方案 4、5、6 或 7 中。
本方案步驟 30 需要的試劑列在第 1 聿方案 23~26 或第 3 章方案 6 或 8 中。
本方案步驟 31 需要的試劑列在第 1 章方案 1 或第 3 章方案 3 中。
本方案步驟 34 需要的試劑列在第 12 章方案 3、4、5 中。
方法
制備用于 BLA31 消化的靶 DNA
1. 將靶 DNA 片段克隆進合適的質(zhì)?；蚴删w M13 載體。
如果擬從靶 DNA 的兩個末端同時構(gòu)建缺失突變體，需要選擇有多克隆位點的適當(dāng)載體將靶 DNA 從兩個方向克隆進載體。
2. 用 Qiagen 層析柱（或相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品）和乙醇沉淀純化閉合環(huán)狀重鉭 DNA。把 DNA 重新溶解在最小體積的 Tris/EDTA 溶液中。
使用高純度的閉合環(huán)狀 DNA 是很重要的，（i) 降低反應(yīng)中污染的 RNA 和大腸桿菌染色體 DNA 小片段在總末端濃度中的比例；（ii）刪除能夠被 BAL31 降解的帶缺口的環(huán)狀 DNA。
3. 用切割位點位于靶 DNA—端的限制酶*消化 30ug 閉合環(huán)狀 DNA。界定該位點為嵌套缺失起始的共同點。瓊脂糖凝膠電泳驗證限制酶消化*。
4. 等體積的酚: 氯仿抽提純化 DNA。在微型離心機上以最大離心速度離心 3 min 分離有機相和水相，將水相轉(zhuǎn)移到一個新的微量離心管中。
5. 加入 0.1 倍體積的 3mol/L 醋酸鈉（PH5.2) 和 2 倍體積冰上預(yù)冷的乙醇。在 O°C 溫度下放置 10 min, 在微型離心機上以最大轉(zhuǎn)速 4°C 離心 10 min 收獲 DNA。
6. 除去上清，用 70% 的乙醇室溫下小心漂洗 DNA 沉淀物。室溫下干燥 DNA 沉淀物，用 TE(pH7.6) 緩沖液溶解 DNA 沉淀物使之達到 lug/ul 的余度。在-20°C 條件下貯存 DNA。
BAL31 活性分析
大多數(shù)商業(yè)化的 BAL31 酶制品含有兩種動力學(xué)上截然不同的酶活性形式：快形式和慢形式（請見信息欄關(guān)于 BAL31)。慢形式是快形式的蛋白水解降解產(chǎn)物。BAL31 消化 DNA 的速率是所用特定酶制劑中快形式與慢形式比例的函數(shù)。目前能夠得到純化的快速酶制劑（Weietal.1983), 但很昂貴，而且在貯存過程中經(jīng)常衰變成慢形式。為了使 BAL31 保持在快形式狀態(tài)，不應(yīng)將酶冷凍而要貯存于 4°C。
由于 BAL31 中快、慢形式的比例因制劑而異，因此必須按以下步驟測定用于構(gòu)建缺失體的特定批次的酶活性。
7. 在微量離心管中混合：
線狀 DNA(1ug/ul) 4ul
水 48ul
5XBAL31 緩沖液 13ul
按的量將以上混合物分配到 7 個微量離心管中。
8. 用 1XBAL31 緩沖液把 BAL31 進行 7 次 2 倍稀釋，最好按以下方法稀釋，將 7 滴（2ul)1XBAL31 緩沖液點在置于冰床或冰冷的金屬塊上的石蠟?zāi)け砻嫔希靡淮涡晕⒘恳埔浩魑^吸取 2ul 待實驗的 BAL31 酶與第一滴 BAL31 緩沖液混合。換一個新的吸頭吸取 2ul 上述 BAL31 和緩沖液的混合物轉(zhuǎn)移至第二滴 BAL31 緩沖液中，再度混合均勻。如此類推，直到所有的 BAL31 緩沖液均已與酶混合。迅速地從后 6 份混合液中分別取出 1 至 6 個含線狀 DNA 的微量離心管中，第 7 個反應(yīng)管中不要加酶。
大多數(shù)商業(yè)化 BAL31 酶制劑的濃度大約為 1 單位/ul;0.05~0.1 單位的 BAL31 酶足以將 1ug 長度為 2kb 的線狀 DNA 分子消化成長度小于 200bp 的片段。
9. 將所有微量離心管（包括不加酶的管）在 30°C 孵育 30 min。
10. 每個反應(yīng)管中加入 1ul200 mmol/LEGTA(pH8.0), 然后于 65°C 加熱 5 min。
BAL31 反應(yīng)需要 Ca2+, 酶活性可以被 EGTA *抑制。65°C 加熱 5 min 也可以使該酶滅活。
11. 以上每份樣品與 3ul 瓊脂糖凝膠上樣緩沖液混合，在含 0.5ug/ml 溴化乙錠 (0.8%) 的瓊脂糖凝膠上電泳，分析 DNA 的大小。
12. 在紫外燈照射下檢査凝膠，并決定合適的酶稀釋度，即剛好使 DNA 得到適度的消化，以至只檢測到彌散的小片段 DNA(200bp)。該稀釋度將被用于大規(guī)模消化反應(yīng)（步驟 15)。
另一種檢査 BAL31 消化程度的方法是設(shè) SBAL31 大量消化反應(yīng)，在不同的時間點上取樣。用限制性內(nèi)切核酸酶消化毎一份樣品，限制酶應(yīng)能切割靶片段數(shù)次。隨著 BAL31 消化過程的進展，限制酶片段以一定的次序消失。從限制酶片段的大小位置，便能估計出 BAL31 的消化速率。大量消化反應(yīng)中使用的 BAL31 量應(yīng)在反應(yīng)開始后的前 5 min 內(nèi)足以使靶片段的長度減少 20%。
用 BAL31 進行大量消化
13. 混合
線狀 DNA(1ug/ul) 20ul
水 240ul
5XBAL31 緩沖液 65ul
30°C 水浴中孵育以上混合物。
14.30°C 孵育期間，準備 8 個微量離心管，每管中含有 5ul 200 mmol/LEGTA(pH8.0)，將離心管標記為 1.5 min、3 min、4.5 min 等時間段。
15. 將 36ul 稀釋的 BAL31(請見步驟 12) 加入到步驟 13 反應(yīng)混合物中，輕敲離心管壁，將內(nèi)容物快速混合均勻后放回到 30°C 水浴中，開始計時。
16. 每隔 1.5 min 將 45ul 反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到帶相應(yīng)標記的微量離心管中，將離心管置于冰上，直到所有樣品收集完畢。
17.65°C 加熱 5 min 滅活 BAL31 酶。
18. 每管中加入 5ul 3 ml/L 的醋酸鈉（PH5.2), 再加入 100ul 冰冷的乙醇，振蕩混合溶液，將離心管放置在冰上 20~30 min。
19. 最大轉(zhuǎn)速 4°C 離心回收 DNA, 除去上清，用 200ul 冰冷的 70% 的乙醇洗滌沉淀物，再離心 2 min。
20. 仔細的去除上清，將敞開管蓋的離心管直立放置在室溫，直到所有的乙醇揮發(fā)殆盡。將每份沉淀物溶解在 23ulTE(pH7.6) 中。
分離截短的靶片段
21. 每份 DNA 制備物中加人：
0.5 mmol/LdNTP 溶液 3ul
10X 聚合酶緩沖液 3ul
噬菌體 T4DNA 聚合酶（約 5 單位） 1ul
室溫下反應(yīng) 15 min, 然后加入 1(約 5 單位）的 Klenow 片段。繼續(xù)在室溫下孵育 15 min。
在修復(fù)反應(yīng)中使用兩種不同的 DNA 聚合酶，可使突變體的回收率增加近三倍。
22. 用酚: 氯仿抽提純化 DNA, 按步驟 18~20 所描述的過程用乙醇沉淀 DNA。將每份 DNA 溶解在 16ulTE(pH7.6) 中。
23. 在毎一份 DNA 中加入 2ul 相應(yīng)的 10x 限制酶緩沖液和 8 單位的可使靶 DNA 和載體分開的限制酶，在適當(dāng)?shù)臏囟认路跤磻?yīng) 1h。
24. 在孵育結(jié)束時，從每一個消化反應(yīng)中取出 3ul 轉(zhuǎn)移至一個新的微量離心管中，剩余的消化反應(yīng)放置在冰上以備步驟 27 使用。
25. 每 3ul 上述反應(yīng)液中加入 1ul 蔗糖凝膠上樣緩沖液混合，將樣品加到含有 0.5ug/ml 溴化乙錠和 0.5XTBE 的瓊脂糖凝膠加樣孔中。凝膠邊上的加樣孔內(nèi)應(yīng)加入一個適當(dāng)大小的分子量標準參照物。
灌制的瓊脂糖凝膠的濃度應(yīng)適合分離靶片段和栽體（請見第 5 章導(dǎo)言部分的表 5-2)。
26. 利用凝膠電泳分離靶片段和載體 DNA, 在紫外光照射下觀察凝膠，并決定哪份樣品已被 BAL31 消化至合適的大小。
27. 合并含合適大小靶 DNA 的質(zhì)粒樣品，按第 5 章方案 4~7 描述的方法通過制備凝膠分離并回收靶 DNA 片段。
28. 根據(jù)溴化乙錠產(chǎn)生的熒光強度，估計出所純化的靶 DNA 量。
克隆缺失的靶片段
29. 用質(zhì)粒、噬菌?；蚴删w M13 載體（見第 1 或第 3 章）與缺失的粑片段連接。載體應(yīng)攜帶一個鈍端和一個與步驟 23 使用的內(nèi)切酶相匹配的末端。
連接反應(yīng)的確切成分和體積取決于靶 DNA 的量，如果可能，應(yīng)使用 50ng 或 100ng 靶 DNA。保證載體 DNA 對靶 DNA 的摩爾比至少為 5(以便最大限度地減少含有一個以上靶 DNA 片段重組子的數(shù)量)。為了最大限度地形成重組體，連接反應(yīng)應(yīng)在適于鈍端連接的條件下進行，例如在高濃度的噬菌體 T4DNA 連接酶、聚乙二醇和低濃度 ATP 的小反應(yīng)體積中進行。有關(guān)連接條件的詳細情況，請見第 1 章方案 19。
30. 用小量的或稀釋的連接混合物轉(zhuǎn)化（質(zhì)?；蚴删＃┗蜣D(zhuǎn)染（噬菌體 M13 復(fù)制型 DNA) 合適的大腸桿菌感受態(tài)菌株。第二天隨機挑選 12 個轉(zhuǎn)化菌落或噬菌體 M13
噬斑進行少量培養(yǎng)。
31. 采用第 1 章或第 3 章描述的方法之一從 12 個培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒、噬菌粒或噬菌體 M13 復(fù)制形式 DNA。用可從載體中切出靶片段的限制酶消化 DNA。
32. 通過凝膠電泳和大小合適的 DNA 分子量標準參照物分析從每種 DNA 中切出的靶片段的大小。
33. 如果結(jié)果是滿意的（例如靶片段的大小在希望的范圍內(nèi)），可大量挑取相互獨立的轉(zhuǎn)化單菌落或噬斑。按上述方法鑒定插入片段的大小。保留攜帶大小符合的重組子培養(yǎng)物。
34. 通過 DNA 測序確定每種突變體缺失位點的準確部位（請見第 12 章方案 3、4 或 5)。以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
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