-
變性聚丙烯酰胺凝膠的制備實(shí)驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間： 2021-12-15 點(diǎn)擊次數(shù)： 2293次材料與儀器
丙烯酰胺溶液 過硫酸銨水溶液 去離子水 去污劑 乙醇 KOH 甲醇溶液 聚硅氧烷溶液 TBE 電泳緩沖液 TEMED 尿素
彈簧夾 干膠架 封膠帶 膠板（配對(duì)的） 和隔板 手套 凡士林 保護(hù)性的工作合紙 鯊魚齒梳子 有臂的燒瓶 隔板 注射器 試管架步驟
材料
緩沖液和溶液
參照附錄 1 配制貯存液、緩沖液、試劑。稀釋貯存液到適當(dāng)?shù)臐舛取?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; color: rgb(77, 88, 101) !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.5rem !important; margin: 0px !important;"/>
丙烯酰胺溶液（45%m/V）
丙烯酰胺（DNA 測(cè)序級(jí)） 434 g
N,N'-亞甲雙丙烯酰胺 16 g
加水 至 600 ml
加熱至 37°C 以促進(jìn)溶解用蒸餾水調(diào)至 1 升，用硝酸纖維素膜過濾（孔徑 0.45ptn). 室溫貯存于棕色瓶中。另外一種較為昂貴的方法是購(gòu)買預(yù)先混合好的丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺粉末，再用水溶解。便宜的丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺粉末通?；旌嫌薪饘匐x子。由此配置的貯存液需要純化，方法是，與 0.2體積的樹脂（MB-1,Mallinckrodt) 混合攪拌，再用 Whatmenl 號(hào)紙過濾。貯存中，丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺會(huì)緩慢的變成酸性，這個(gè)脫氮基過程由光和堿催化。保持溶液 pH 值在7.0 或者以下，在黑色瓶中保存于室溫應(yīng)該每幾周重配一次。
過硫酸銨水溶液（1.6%m/V)
去離子水
去污劑
乙醇
KOH/甲醇溶液
在 100ml 甲醇中加入 5 gK0 H 配成，用于清洗玻璃板，貯存在密閉的玻璃瓶中。
聚硅氧烷溶液
傳統(tǒng)的聚硅氧烷溶液中包括二氯二甲基硅，它有毒性、揮發(fā)性并且易燃。近年來(lái)，出現(xiàn)了一些無(wú)毒的替代物，包括 Gel Slick(FMC Bioproducts)、RainX(Unelko，Scottsdale Arizona), 和 Acrylease(Stratagene)。
10XTBE 電泳緩沖液
TBE 在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)的濃度是 lx(89 mmol/L Tris-硼酸，2 mmol/L EDTA)，這一濃度是瓊脂糖電泳用量的 2 倍（請(qǐng)見第 5 章）。用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的垂直電泳槽的緩沖液池一般較小，故所通過的電流量通常相當(dāng)大。要用 lxTBE 才能夠保證適當(dāng)?shù)木彌_容量。緩沖液的 pH 值應(yīng)接近8.3。一般無(wú)須調(diào) pH 值；可是，對(duì)于每次新配的 10XTBE 電泳緩沖液都要認(rèn)真檢査 pH 值。
使用同樣的 10xTBE 電泳緩沖液配制膠和工作緩沖液，因?yàn)閮烧咧g微小的差異也會(huì)導(dǎo)致 DNA遷移時(shí)嚴(yán)重扭曲。
使用氨基乙磺酸（36 g/L 的 10XTTE 緩沖液） 取代標(biāo)準(zhǔn) TBE 溶液中的硼酸可以減少由于形成甘油-硼酸陰離子脂類化合物而導(dǎo)致的在膠的頂部的條帶扭曲<Pisa-Willanson and Fuller1992)。若需要更多的信息請(qǐng)參見 DNA 測(cè)序反應(yīng)中的甘油一節(jié)。
TEMED(N,N，N',N'-四甲基乙二胺）
電泳級(jí)的 TEMED 在很多公司有售（Sigma,Bio-Rad),TEMED 容易吸潮，必須 4°C 貯存在密閉的瓶中。它是聚合反應(yīng)中的連接催化劑。
尿素，固體
特殊裝置
彈簧夾：5 cm 長(zhǎng)，每塊膠 5 到 7 個(gè)。
干膠架
雖然不重要，干膠架對(duì)于干燥和貯存測(cè)序用的玻璃平板是非常方便的（Bio Whitraker)。
封膠帶
例如 3M Scotch Stretchable Tape(Lab Safety Supply,Janesville，Wisconsin)，3M Scotch yellow electrical tape#56(Life Technologies),3M Scotch polytetrafluorethylene(PFTE)extruded film tape。關(guān)于不同種膠帶的用法和其他封膠的方法，參見 Hengen(1996)。
膠板（配對(duì)的） 和隔板
制膠的板一塊比另一塊略長(zhǎng) 3.5-4.0 cm, 或者有一塊板是缺刻的。為避免膠板裂了或者漏了，最好保持板是配對(duì)的并且和測(cè)序膠的槽相對(duì)應(yīng)。
手套
無(wú)滑石粉、易處理的橡膠或者聚氯乙烯（PVC)。
凡士林
可選擇，見步驟 4
保護(hù)性的工作合紙
一面是塑料的（Kaydry Lab Cover from Fisher) 或者 Benchkote。
鯊魚齒梳子
0.4 mm 厚,32,64 或 96 齒. 依賴電泳裝置的能力。
有臂的燒瓶（250 ml)
隔板（厚度一致或者邊緣較窄）
每膠兩板，由有彈性的薄塑料板（0.4 mm) 或特氟?。⊿anger and Coulson 1978） 制成，使玻璃板隔開。在膠板和隔板之間形成不透水的封口，使未凝固的膠溶液不會(huì)漏出。
邊緣窄的隔板用于制造底部比頂部厚的膠，使底部的條帶比較窄并且整塊膠的條帶比較均勻。雖然它有這樣的優(yōu)點(diǎn)，但是比較難以制備和干燥。
注射器（60cc)
可選擇，見步驟 15.
試管架
55°C 水浴
方法
重要：為防止皮膚油脂的污染. 必須一直帶無(wú)滑石粉的手套，并且只能拿板的邊沿。
準(zhǔn)備膠板
1. 必要時(shí)，甩 KOH/甲醇清洗板上的舊污漬。
2. 然后用溫的去污劑溶液洗滌玻璃板和間隔片，用自來(lái)水*沖洗，再用去離于水洗凈。用乙醇沖洗玻璃板去掉水印，并放于一旁晾干。
必須小心翼翼地洗凈玻璃板. 以確保灌膠時(shí)不會(huì)產(chǎn)生氣泡。
3. 小塊玻璃板的內(nèi)面用聚硅氧烷溶液處理。在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)將玻璃板放在一疊紙巾上, 內(nèi)表面向上，在上面傾倒少量硅烷化液。用幾張 Kimwipes 紙?jiān)诓ＡО灞砻鎸⒐柰榛和坎季鶆?，讓玻璃板風(fēng)干（l~2 min）。然后用去離子水洗，再用乙醇洗，風(fēng)干。
4. 把大塊玻璃板（干凈面朝上）放在空的試管架上，把隔片放在玻璃板的兩邊（見圖12-9)。
如果用邊沿窄的隔片，把厚的一邊放在板的底部。在大板和隔片之間加入小滴凡士林使隔片在下一步時(shí)不會(huì)移動(dòng)。
5. 再將較?。ɑ驇О伎冢┑牟ＡО逶陂g隔片上放置妥當(dāng)，對(duì)齊隔片。
6. 用若干個(gè)大彈簧夾（長(zhǎng) 5 cm) 將玻璃板的一邊夾起來(lái)。
在玻璃板另一邊及玻璃板底部貼上凝膠密封帶，形成不透水密封，必須特別注意玻璃板的底角，因?yàn)檫@是最容易發(fā)生滲漏的地方。
7. 將彈簧夾換到已封好的一邊，在玻璃板的另一邊貼上凝膠密封帶。
8. 將梳子放在膠模的敞開端并檢査是杏貼切適合，取出梳子將空膠模放在實(shí)驗(yàn)桌上。
配膠
9. 在實(shí)驗(yàn)桌的工作區(qū)上鋪上襯塑料的保護(hù)紙。
灌制測(cè)序凝膠時(shí)幾乎不可能避免將丙烯酰胺溶液滴于桌面。
10. 在一個(gè) 250 ml 有臂錐形瓶中配制適當(dāng)濃度的丙烯酰胺溶液（表 12-19)。這些溶液足夠配制一塊 40 cmx40 cm 的測(cè)序凝膠。
注意：凝膠的配制必須一氣呵成，中間不能斷斷續(xù)續(xù)。
11. 混合所有試劑，在 55°C 水浴中加熱 3 min 幫助尿素溶解。
溶解尿素的過程十分緩慢，必須依靠外部的熱量。大約的體積是 66 ml, 加水到 100 ml。
12. 從水浴中取出溶液，冷卻 15 min 至室溫。不斷攪拌混合物。
13. 把燒瓶放在真空裝置里抽去氣體。
防止聚合時(shí)產(chǎn)生氣泡。
14. 把溶液放入 250 ml 玻璃燒杯中。加 3.3 ml 新制的 16% 的過硫酸銨，混勻。
舊的硫酸銨沒有足夠的聚合能力，會(huì)產(chǎn)生模糊的條帶。
15. 加 50ulTEMED，輕輕旋動(dòng)容器以混勻溶液。直接配膠?；蛘哂?60cc 注射器吸取上述溶液約 40 ml。注意，不要有氣泡。
與蛋白電泳相比，已經(jīng)使用了最大量的 TEMED，確保了聚合足夠快和足夠均勻。聚合速度與時(shí)間有關(guān), 溫度越低聚合越慢。有經(jīng)驗(yàn)的人利甩預(yù)冷卻的方法可以用一次配制的混合物制成多塊 40 cmx40 cm 膠。
從此步開始，動(dòng)作盡可能迅速。
16. 用手托住膠模使之與水平面大約成 45°角，沿一邊從移液管中緩緩灌入溶液（參見圖 12-9)。
17. 將模子放在試管架上（見圖 12-9)。
這一位置減少了模子底部的水壓，防止漏膠。
18. 立即將鯊魚齒梳子的平整側(cè)插入凝膠液約 0.5 cm 處，梳子兩端插人液面的深度應(yīng)當(dāng)?shù)韧?，以便使凝膠垂直放置時(shí)梳子的平整表面能夠保持水平。
如果梳子旁邊可見氣泡，慢慢取出梳于。洗凈梳子表面，重新插入膠中。
19. 用彈簧夾夾住梳子使之就位。將剩余的丙烯酰胺-尿素溶液沿凝膠頂部加入，形成一串丙烯酰胺液滴。讓凝膠在室溫下聚合 15 min。
20. 沖洗 60cc 注射器以免被聚合的丙烯酰胺所堵塞。
警告：沖洗時(shí)將釋放出少量未聚合的丙烯酰胺，應(yīng)戴手套。
21. 聚合 15 min 后對(duì)凝膠進(jìn)行檢査，觀察是否恰恰在梳子平整表面之下出現(xiàn)一道折射率不同的 Schlieren 線，這道線是聚合理想的標(biāo)志。聚合完畢后（大約 1 小時(shí)），取下彈簧夾。
警告：沖洗時(shí)將釋放出少量未聚合的丙烯酰胺，應(yīng)戴手套。
22. 聚合完畢后，凝膠可立即使用（見方案 11)，或保存于室溫達(dá) 24 小時(shí)，或保存于4°C 48 小時(shí)。為防止保存期間發(fā)生脫水，可將梳子留于凝膠內(nèi)并在凝膠頂部圍放一些用 1XTBE 濕潤(rùn)的紙巾，紙巾可用 Saran 包裝膜覆蓋。在這一階段不要拔掉梳子。
以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物科技有限公司介紹：
安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。
-
血清系列
-
細(xì)胞轉(zhuǎn)染
-
支原體清除
-
細(xì)胞凍存
-
實(shí)驗(yàn)耗材
-
分子試劑
-
細(xì)胞增殖與凋亡
-
Biozellen系列
-
培養(yǎng)基
-
ELISA試劑盒
-
TOYOBO（東洋紡）
-
ZYMO RESEARCH
-
Greiner（格瑞納）
-
IKA（艾卡）
-
化學(xué)發(fā)光底物（ECL）
-
PROSPEC系列
-
Epigentek系列
-
微生物檢測(cè)
-
細(xì)胞生物學(xué)
-
Corning康寧
-
解離試劑
-
細(xì)胞類-實(shí)驗(yàn)耗材
-
原代細(xì)胞
-
植物檢測(cè)系列試劑盒
-
SERANA
-
細(xì)胞系
-
生化試劑盒
-
環(huán)境檢測(cè)系列試劑盒（AKEN）
-
類器官培養(yǎng)
-
緩沖器和解決方案
-
生物三凝膠基質(zhì)
-
細(xì)胞因子分子
-
生物樣本庫(kù)
-
蛋白研究系列
-
修飾檢測(cè)試劑盒
