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細胞自噬的實驗方法詳解
發(fā)布時間： 2021-12-10 點擊次數(shù)： 4533次自噬（autophagy）被認為是維持細胞穩(wěn)態(tài)的關鍵過程，也是對等壓力源的反應，如營養(yǎng)缺乏，這可能會危及細胞的生存。當細胞接觸到這些壓力源時，原本在低水平發(fā)生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就會被大幅度上調。這種上調會增加了細胞的吸收和降解，將大分子釋放回胞質中以驅動必須的代謝反應并產生能量。
在正常和壓力條件下，自噬對細胞健康的貢獻，意味著這種嚴格調控和精確協(xié)調過程的重要生理和病理作用。事實上，自噬在哺乳動物的發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)是有用的。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)自噬是各種疾病和病癥的重要調節(jié)器。探索自噬在發(fā)育和疾病中的參與，對于更全面地了解這一途徑的作用至關重要，并且可能對保持健康或治療疾病有影響。
自噬的研究已經成為如今醫(yī)學研究的常客，發(fā)文量也十分巨大，成為常規(guī)生物學現(xiàn)象來研究，但是有一些實驗上的技巧值得探討一二，例如一些試劑的使用等等
1、自噬相關試劑的使用。
①MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其濃度為50 mmol/L,分裝后-20冰箱保存。臨用前用MEM稀釋到終濃度50 umol/L;
②Rapamycin:用MEM培養(yǎng)基配成終濃度為1 umol/L,現(xiàn)用現(xiàn)配;
400ng/ml喹乙醇:稱取4 mg喹乙醇,DMSO預溶(體積<0.1%)后加入10 ml MEM培養(yǎng)液至*溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光保存;
③3-MA:首先用PBS溶解粉末,臨用前加熱至*溶解后再加入MEM培養(yǎng)基至終濃度10mmol/L;PI3K抑制劑（3-MA，Wortmannin）可干擾或阻斷自噬體的形成；
用RAPAMYCIN誘導自噬我也查過一部分文獻，有用無血清的，也有用，一般培養(yǎng)基的，濃度從25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培養(yǎng)基中，目的是排除無血清所誘導出來的自噬。
文獻說饑餓初期激活的是大分子自噬，在4-6小時活力達到最大，24h后以CMA途徑為主
④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h
sigma的EBSS，貨號E2888，有碳酸氫鈉，有酚紅的，酚紅到不是很必須，只是一個PH指示作用，好看些
⑤無血清誘導自噬：EBSS 誘導6個小時就可以了。
EBSS一定可以誘導出來，只是需要說明的是時間點的設置，因為從饑餓誘導開始半個小時就可能開始自噬了，一直到24小時都持續(xù)，所以應該設置不同的時間點觀察這個作用。另外一個很大的問題是，饑餓誘導的一個很大的弊端是細胞死亡，這也是我面臨的問題，就是在細胞收養(yǎng)的時候蛋白濃度太小了。24小時就很少了，更不要說48小時和72小時了。
⑥Hank's誘導，也就是通常所說的饑餓誘導，細胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期后以Hank's替代常規(guī)*培養(yǎng)基，3h后就可誘導出自噬。我用Hank's誘導了3h后電鏡觀察有30%細胞都有自噬這種現(xiàn)象，但不如國外報道的高。
⑦sigma的氯喹的貨號C6628。用氯喹做自噬抑制劑，293T細胞50uM就可以。1. 可以用雙蒸水配制2. 配制后4度保存
不同的自噬抑制劑機制不同。抑制的步驟也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后續(xù)的步驟，Chloroquine抑制自噬體與溶酶體的融合過程，autophgy不能完成，所以lc3才會累積。因此加了抑制劑lc3之后會比不加的要高。氯喹能提高溶酶體中的pH值，使溶酶體中的酸性水解酶喪失活性，從而導致“自噬溶酶體"不能降解，因此，位于自噬體和自噬溶酶體膜上的LC3不能按時降解，表現(xiàn)為LC3熒光長時間的保留或WB中LC3條帶變粗。
⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制劑）抑制EV71感染所引起的細胞凋亡，觀察細胞的自噬情況。研究發(fā)現(xiàn)，抑制細胞凋亡能增加LC3-I轉化為LC3-II以及p62的降解。
1. 雷帕霉素：作為以mTOR 為靶點較為經典的誘導劑已經被廣為應用，推薦工作濃度為1μmol-10μmol；
2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作為溶酶體的抑制劑，可以抑制自噬體與溶酶體的融合從而可以用來作為自噬以及自噬流的抑制劑用于實驗研究，推薦使用濃度：10umol-50umol。
2、自噬誘導劑
正常培養(yǎng)的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節(jié)，經報道的藥物有：
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）
(3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑
(5) Rapamycin：mTOR抑制劑
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
3、自噬抑制劑
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制劑
(2) Bafilomycin A1：質子泵抑制劑
(3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）
衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司產品,貨號:T7765 ;溶于DMSO中配成儲存液,使用時DMSO終體積濃度不超過1/1000。
3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司產品,貨號:M9281;溶于滅菌超純水制成儲存液。
氯喹二磷酸鹽(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司產品,貨號:C6628;溶于滅菌超純水中制成存液。
雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司產品,貨號:R8781;
4、MDC染色焚光顯微鏡檢測細胞自睡
單丹黃酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一種突光染料,被用作自吞泡的示蹤劑。具體操作步驟如下:
(1)將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞按常規(guī)方法消化后接種于6孔板,每孔接種1x106個細胞;
(2)細胞密度達到60%-70%時,棄去培養(yǎng)液,小心用PBS洗1遍,分別用含TG濃度為0、0.5、1 nM的培養(yǎng)基及含Rapamycin (終濃度1 pM)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h;
(3)棄上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(終濃度50 nM)的培養(yǎng)基于37 V、5% CCh的恒溫培養(yǎng)箱中避光溫育20 min;
(4)取出六孔板置于勞光顯微鏡下,Ih內觀察細胞自唾發(fā)生情況并拍照。
5、流式細胞術檢測細胞自噬發(fā)生率
(1)取對數(shù)生長期的HepG2細胞,接種于6孔板,培養(yǎng)24h之后,分別用含TG濃度為0、1、2、4、8uM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h和0.5uM的TG作用不同時間(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,將上清收集到4 ml的離心管中;
(2)每孔加入2ml含MDC(終濃度50nM)的MEM培養(yǎng)基,于37°C、5%0?的恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育30 min;
(3)將收集的上清2000rpm,離心5min;
(4)棄掉上清,每管加入500ul含MDC(終濃度50 uM)的MEM培養(yǎng)基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;
(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混勻收集到1.5ml的離心管中,2000 rpm.離心5 min;
(6)棄掉上清,加1ml的PBS重懸,2000rpm,離心5 min;
(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;
(8)鮮育完的上清,2000rpm,離心5 min;
(9)棄掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的離心管中,2000 rpm,離心5 min;
(10)重復步驟(6)和(7);
(11)將上述兩個相同濃度或相同時間點的兩管混勾,過300目銅網上機檢測。流式細胞
儀以488nm激發(fā)波長測定MDC染色的熒光強度。
LC3B WB: 1:2000
條件是15% SDS-PAGE, 正常跑膠至下沿0.5cm即可，200mA 濕轉45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封閉1h，4C過夜搖動孵育，洗抗體3*5min即可
LC3B的Western-blot檢測，配置的15%的分離膠，濕轉250mA，60min
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