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背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟
發(fā)布時(shí)間： 2021-11-08 點(diǎn)擊次數(shù)： 2489次材料與儀器孵化8-12d的雞胚。孕15d及新生1-3d的大、小鼠仔鼠
含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 神經(jīng)元維持培養(yǎng)基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺+20ng mlNGF) 10µM阿糖胞苷(ARA-C)
培養(yǎng)瓶實(shí)驗(yàn)步驟獲得消毒動(dòng)物后詳細(xì)的步驟如下：
1．無菌條件下仰臥放置胚胎或仔鼠于冰D-PBS液中，斷頭后打開胸腹腔，除去內(nèi)臟器官。從頸部椎管開口插入顯微剪，沿脊柱背側(cè)中線兩側(cè)剪開椎管，去除暴露脊髓后，即在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側(cè)排列的背根節(jié)，用精細(xì)顯微攝小心提取，并剝除其被膜。
2.若施行組織塊培養(yǎng)，可用精細(xì)顯微剪將每個(gè)背根節(jié)剖為2-3個(gè)植塊，直接接種于涂有鼠尾膠的基質(zhì)上，加少量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。
3.如若需要背根神經(jīng)節(jié)分散細(xì)胞培養(yǎng)，則可將分離好的DRG組織塊收集入0.25%胰蛋白酶液中37℃消化30min。加人10滴胎牛血清終止消化后，900r/min離心5min,去除上清。而后依照總論的方法在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為(0.5-1)X105/ml接種細(xì)胞于多聚賴氨酸包被的介質(zhì)上，37℃,5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。
4.以上兩種培養(yǎng)方法24h后均傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用無血清培養(yǎng)液(Neurobasal+827+谷氨酰胺+20ng/ml NGF)培養(yǎng)。接種第3天，加入細(xì)胞分裂抑制劑ARA-C以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的增殖，作用48h后半量更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周1/2量換液2次。
5.純化培養(yǎng)的DRGs可以存活2個(gè)月之久，純度可達(dá)96%以上。分散培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元48h可見胞體有光暈感，圓形或橢圓形，大小不一，有多極、雙極和假單極神經(jīng)元。2d后給予抑制劑處理后，DRG突起生長(zhǎng)迅速，形成稀疏網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長(zhǎng)并增粗，神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加致密，雜質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)脫壁漂浮，培養(yǎng)物背景變得干凈清晰很多，免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)一步鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為神經(jīng)絲(NF)陽性（圖1-3)。
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