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細胞培養(yǎng)技術(shù)

發(fā)布時間： 2021-10-29　　點擊次數(shù)： 2350次

簡介

一.細胞培養(yǎng)的基本原理
細胞培養(yǎng)是用酶消化法將組織碎塊分離成單個細胞，用培養(yǎng)基制成細胞懸液，在體外適宜條件下，使細胞生長繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。細胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)主要不同點在于原始培養(yǎng)的對象不同。細胞培養(yǎng)使用的是單個細胞懸液，組織培養(yǎng)使用的是組織塊(0．5～1立方毫米)或薄片(厚0．2毫米)，而器官培養(yǎng)使用的是器官原基或器官的一部分或整個器官。在組織培養(yǎng)中，細胞自組織塊周圍移出并生長，細胞在生長過程中總有移動(運動)或其它變動，這樣就使被培養(yǎng)的組織難以長期維持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)時間越長，發(fā)生變化的可能性越大，結(jié)果常使單一類型的細胞保存下來，最終成了細胞培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)中，細胞生命活動和體內(nèi)細胞一樣，仍然是相互依存的，呈現(xiàn)一定的組織特異性，所以組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)實際上無嚴格區(qū)別。

細胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學中常用的研究手段，該方法能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝、腎解毒功能的干擾，觀察某些因素或藥物對培養(yǎng)細胞的直接作用。通過實驗可獲得某一類型細胞的純培養(yǎng)。如心肌組織中心肌細胞約占50％，非心肌細胞占50％；而經(jīng)純化分離的心肌細胞懸液中，心肌細胞可達95％以上，這樣，心肌細胞原代培養(yǎng)實驗基本不受其它細胞的干擾。在細胞培養(yǎng)實驗中能直接觀察到培養(yǎng)細胞生命活動的動態(tài)過程；用定時顯微攝影記錄可發(fā)現(xiàn)一些肉眼觀察不到的生命現(xiàn)象；還可利用電鏡手段、同位素標記、放免法和免疫組化法等來研究細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及細胞內(nèi)化學物質(zhì)的分布。此外，還能節(jié)約研究費用。如在某些研究中，用100只動物做實驗所獲得結(jié)論與用100張蓋玻片或幾十個培養(yǎng)瓶而獲得結(jié)論具有相同的統(tǒng)計學意義，而細胞培養(yǎng)較之大批量的動物飼養(yǎng)花費要小。

但細胞培養(yǎng)方法也存在不足之處：培養(yǎng)細胞失去體內(nèi)細胞的制約和整體的調(diào)節(jié)作用，細胞形態(tài)和功能會發(fā)生一定程度的改變。培養(yǎng)方法、實驗試劑對細胞形態(tài)和功能有一定的影響，如胰蛋白酶可破壞細胞表面受體、酶、抗原等。長期體外培養(yǎng)的細胞，由于反復(fù)傳代、凍存和操作等因素的影響，可能發(fā)生染色體非整倍體改變，呈永生化或癌變的特征。

材料與儀器

二.細胞培養(yǎng)的基本設(shè)備與用品
(1)細胞培養(yǎng)的基本設(shè)備
細胞培養(yǎng)的基本設(shè)備有：CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，凈化臺，壓力蒸汽消毒器，自動雙重純水蒸餾器，液氮罐，冰箱，電熱干燥箱，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電動吸引器，抽氣泵等。
(2)常用的實驗用品
1.玻璃器皿
細胞培養(yǎng)所用的玻璃器皿應(yīng)由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃制成。常用的有以下幾種：國產(chǎn)螺旋口培養(yǎng)瓶[有12．5毫升，25毫升，100毫升等規(guī)格，國外培養(yǎng)瓶常以底面積(平方厘米)表示]；培養(yǎng)皿(直徑有3．5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等規(guī)格)；離心管(5毫升，10毫升)；注射器(1毫升，5毫升等)；用生理鹽水瓶代替的貯存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升)；青霉素瓶(5毫升)；西力辛瓶(10毫升)；其它還有尖吸管和移液管，載玻片(厚度0．8～1．2毫米)，蓋玻片(厚度0．12毫米)，貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒，漏斗，燒杯，量筒，貯蒸餾水瓶，冷凍管(1．5毫升，2毫升)等。
2.塑料品
多孔培養(yǎng)板規(guī)格有4、6、12、24、96孔等，培養(yǎng)皿直徑有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品經(jīng)消毒滅菌密封包裝，供一次性使用，重復(fù)使用的需經(jīng)特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均勻，有的表面經(jīng)特殊處理，細胞易于生長。
3.器械
解剖刀、眼科剪和鑷(直頭和彎頭)、中號圓頭鑷、止血鉗等。
4.雜用品
金屬飯盒、試管架、各種規(guī)格膠塞、記號筆、搪瓷盤、吸頭(吸取液體的膠帽)、酒精燈、酒精、火柴、碘酒棉球瓶等。
組織培養(yǎng)中使用最多的是吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及各種瓶塞。實驗者手中應(yīng)有三套器材，瓶塞數(shù)要大于瓶數(shù)，才能保證實驗中的循環(huán)使用。

實驗步驟

三.細胞培養(yǎng)用品的清洗與消毒滅菌
(1)清洗
1.常用玻璃器皿清洗
◇清洗要領(lǐng)
浸泡
初次使用的玻璃器皿呈堿性，表面常附有灰塵和一些對細胞有毒的物質(zhì)，如鋁和砷等?？諝鉂穸雀邥r，玻璃器皿表面又易長霉。使用前，新器皿浸泡在5％稀鹽酸中過夜，以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)并去除霉斑；然后經(jīng)簡單刷洗，流水沖洗(逐片進行)，蒸餾水浸泡，干燥備用。新玻片處理后，短時間不用時，需將它投入95％的酒精中保存，以防玻片長霉。培養(yǎng)后的玻璃器皿應(yīng)立即投入清水中浸泡，器皿中殘留的細胞、蛋白質(zhì)一旦干涸，即固著于玻璃表面，極難脫落。
刷洗
用過的玻璃器材經(jīng)自來水沖洗后，浸入水中煮沸，然后將適量洗滌劑(洗潔精或洗衣粉)投入沸水中繼續(xù)煮沸10分鐘，趁熱刷洗器皿內(nèi)外，刷洗后浸入清水中進行沖洗。
酸泡
刷洗好的玻璃器材干燥后置清潔液中浸泡24小時，清潔液的強氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質(zhì)。
◇清洗步驟
玻璃器材煮沸10分鐘→刷洗→流水振蕩沖洗15-20遍→50℃烤干→清潔液浸泡24小時→流水振蕩后沖洗15-20遍→漓水→蒸餾水浸泡2次(每次24小時)→50℃烤干，待包裝。
◇清洗注意事項和要求
①使用后的實驗器材應(yīng)立即投入清水中。
②浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體，不得有氣泡。
③刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗，不得殘留洗滌劑、清潔液。方法是：每瓶灌2／3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復(fù)15―20次(尖滴管置量杯中沖洗)。
④煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑(直徑35厘米的鋁鍋，用洗衣粉10克左右)。若洗滌劑和實驗器材同時從冷水煮至沸騰或使用過量洗劑，均易腐蝕玻璃表面，使玻璃堿化，pH值上升。
⑤軟毛刷的刷端已掉毛的應(yīng)該棄去，否則會損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑，會改變培養(yǎng)液pH值和毒害細胞。
⑥清潔物品應(yīng)及時包裝消毒，應(yīng)注意妥善保存，防止落入灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。
⑦使用后的膠塞與玻璃器材同時煮洗時，膠塞要放在煮鍋的底部。
⑧浸泡器材的蒸餾水容器要專用，并做好標記，如“蒸餾水Ⅰ盆"、“蒸餾水Ⅱ盆"。
⑨器材清洗干燥后，在以后各步操作時，手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進行操作，省時又保證清洗質(zhì)量。
⑩用超聲波儀清洗器材時，清洗要求同上。
2.橡膠制品的清洗
新購置的橡膠制品(膠塞、膠管、橡皮乳頭)的洗滌方法如下：0．5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘→流水沖洗→0．5摩爾/升HCl煮沸15分鐘→流水沖洗→自來水煮沸2次→蒸餾水煮沸20分鐘→50℃烤干備用。這樣處理可*除凈膠塞上的硫磺等有毒物質(zhì)。用過的膠塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑，流水沖不凈，故膠塞洗刷的重點部位是膠塞使用面，用刷逐個刷洗。在使用過程中，膠塞不能與培養(yǎng)液接觸，以防未洗凈的膠塞污染培養(yǎng)液和細胞。
3．G6除菌濾器的清洗
新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時，流水緩慢沖洗，至pH值為5．5左右，然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗，再用重蒸餾水緩慢沖洗，烤干，包裝消毒備用。用過的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意：濾器千萬不能干涸)過夜，流水緩慢沖洗24小時或更長時間，至濾面基本疏通時，50℃烤干，濾器再置清潔液中浸泡24小時，或裝滿清潔液自然過濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。
4.正壓除菌濾器的清洗
新的或使用后的正壓濾器經(jīng)稀洗滌劑刷洗一次流水沖洗15分鐘→漓水→去離子水浸泡24小時→三蒸水浸泡24小時→干燥備用。
5.塑料制品的清洗
塑料制品質(zhì)地軟且耐腐蝕能力強，但不耐熱，易出現(xiàn)劃痕。其清洗程序為：器皿用后立即用流水沖洗→浸于自來水中過夜→用紗布、棉簽和50℃稀洗液刷洗→流水沖洗(人工沖洗15―20遍)→晾干→浸于清潔液中15分鐘→流水沖洗→蒸餾水浸泡兩次(每次24小時)→晾干備用。
6.清洗液的配制
清潔液
新配制的清潔液為棕紅色，遇有機溶劑或水分增多時變成綠色，表明失效。
先在搪瓷盆中加入蒸餾水，加熱溶解重鉻酸鉀，再將盆置流動自來水中，待重鉻酸鉀液冷卻后，緩慢加入濃硫酸，邊加邊用玻棒攪動，以混合液溫度不過快上升和不出現(xiàn)重鉻酸鉀結(jié)晶為度。
玻璃濾器洗液
取10克硝酸鈉和28．6毫升濃硫酸，放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內(nèi)混勻備用。

清潔液配方

配方成分
常用方
弱液
次強液
強液
重鉻酸鉀（g）
100
50
100
60
清水（ml）
800
1000
1000
200
濃硫酸（ml）
200
90
160
800
硫酸濃度（v/v）
20%
8%
14%
80%
(2)消毒滅菌
 1.濕熱消毒

◇濕熱消毒的要求
 使用壓力蒸汽滅菌器進行濕熱消毒。
①消毒物品不能裝得太滿，物品之間應(yīng)留有空隙，以利于消毒器內(nèi)蒸汽的流動。
②排氣管要插入消毒器的槽內(nèi)。若排氣管斷裂，要將排氣管與排氣閥調(diào)至同一位置。
③玻璃器材使用端(管口、瓶口)要向下放置。
④液體消毒時，用棉塞或插有針頭的膠塞封瓶口。
⑤加熱前將放氣閥摘子置垂直位(開放)，消毒器內(nèi)空氣隨溫度升高由此閥孔逸出，容器內(nèi)冷空氣隨之排出。當水煮沸時，有一股較急的蒸汽沖出時，將放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉)。排除冷空氣的另一種方法是：放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉)，加熱，壓力升至5磅時，將摘子置垂直位(開放)，冷、熱空氣先后排出(可用手試)。待壓力指針回歸零位時，放氣閥摘子再置水平位(關(guān)閉)。
⑥繼續(xù)加熱，當消毒器內(nèi)升壓至需要壓力時，計時并使壓力恒定。壓力維持方法：用電加熱時，可通過電源和滅菌器間的穩(wěn)壓器調(diào)節(jié)；沒有穩(wěn)壓器時，用放氣閥摘子自動排氣調(diào)節(jié)；用煤氣加熱時，可調(diào)節(jié)火力維持壓力。根據(jù)消毒物品種類不同所選擇的消毒壓力和時間也不同，一般物品(如布類、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20分鐘；橡膠制品為10磅10分鐘；常規(guī)液體消毒15磅15分鐘。一般認為在這種壓力下1分鐘內(nèi)幾乎可殺死所有微生物，但由于消毒物品的包裝內(nèi)仍可能留有冷空氣，而使高壓蒸汽不能達到消毒器的各部分，所以要延長消毒時間。
⑦消毒完畢，待壓力指針降至零位，再等數(shù)分鐘，待放氣閥摘子放完氣后打開消毒器蓋。液體瓶口棉塞換膠皮塞或拔去膠皮塞針頭換新塞。

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產(chǎn)品中心 Products

配方成分	常用方	弱液	次強液	強液
重鉻酸鉀（g）	100	50	100	60
清水（ml）	800	1000	1000	200
濃硫酸（ml）	200	90	160	800
硫酸濃度（v/v）	20%	8%	14%	80%

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