帶你走近細(xì)胞生物學(xué)世界的第一步——細(xì)胞培養(yǎng)

發(fā)布時(shí)間： 2021-10-21　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1730次

細(xì)胞培養(yǎng)的概念：

細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無(wú)菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件等），使之生存、生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)大量培養(yǎng)成為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等。

細(xì)胞培養(yǎng)所需的儀器設(shè)備：

倒置顯微鏡		便于掌握細(xì)胞的生長(zhǎng)情況（細(xì)胞形態(tài)、大小、密度、結(jié)構(gòu)）并觀察有無(wú)污染等
細(xì)胞培養(yǎng)箱		可以精確地提供細(xì)胞培養(yǎng)需要的溫度、濕度、氣體環(huán)境，有效防止細(xì)胞污染
超凈工作臺(tái)		用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的無(wú)菌操作
低速離心機(jī)		制備細(xì)胞懸液、調(diào)整細(xì)胞密度、洗滌、收集細(xì)胞（800rpm-1000rpm，5min）
水浴鍋		用于細(xì)胞復(fù)蘇、預(yù)熱培養(yǎng)基等
移液槍		用于吸取、移動(dòng)液體或滴加樣本
細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿		用于培養(yǎng)、繁殖細(xì)胞
細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材		用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中收集細(xì)胞，保存細(xì)胞等

細(xì)胞培養(yǎng)所需的試劑：

培養(yǎng)基	為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)
緩沖溶液	用于清洗細(xì)胞，去除沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)的舊培養(yǎng)基及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，為細(xì)胞提供適宜的pH作用及鹽平衡作用
血清	提供細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖所需的生長(zhǎng)因子、激素、各種蛋白、促進(jìn)貼壁和伸展的因子及細(xì)胞傳代時(shí)所需的蛋白酶抑制劑和其他多種不明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)
胰蛋白酶	使細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)水解，從而使細(xì)胞分離，常用于細(xì)胞傳代
抗生素	防止細(xì)胞污染，使細(xì)胞在體外的無(wú)菌環(huán)境中更好的生長(zhǎng)
凍存液	提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，并且緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷，最大限度的保持細(xì)胞活力
其他添加成分	為不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件提供特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

細(xì)胞培養(yǎng)的類(lèi)別：

原代細(xì)胞(primary cell)是指從機(jī)體的組織中經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得、并在體外進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞，稱(chēng)為原代細(xì)胞。一般認(rèn)為，培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

細(xì)胞系(cell strain)：原代培養(yǎng)物經(jīng)胰酶等物質(zhì)第一次消化傳代后即為細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞系所組成。如果不能繼續(xù)傳代，或傳代次數(shù)有限，可稱(chēng)為有限細(xì)胞系，如可以連續(xù)培養(yǎng)，則稱(chēng)為連續(xù)細(xì)胞系，培養(yǎng)50代以上并無(wú)限培養(yǎng)下去。

細(xì)胞株(cell line)：從細(xì)胞系中用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱(chēng)細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代有限，稱(chēng)為有限細(xì)胞株；如果可以連續(xù)傳代，稱(chēng)為連續(xù)細(xì)胞株。

細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程：

細(xì)胞復(fù)蘇：

將凍存的細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)直到*融化后放入離心機(jī)中，800rpm-1000rpm，5min，然后在超凈臺(tái)中將上清液棄掉，加入1ml預(yù)熱的培養(yǎng)基，輕輕吹勻后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足細(xì)胞生長(zhǎng)所需的培養(yǎng)基，呈“十"混勻后放入含5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：

細(xì)胞凍存：

待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用5ml PBS清洗3次。加入一定量含0.25% EDTA的胰蛋白酶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中（不同的細(xì)胞消化時(shí)間不同）。待細(xì)胞消化*后加入胰蛋白酶的3倍體積的含血清培養(yǎng)基進(jìn)行中和，輕輕吹吸混勻，轉(zhuǎn)移到離心管中800rpm-1000rpm，5min進(jìn)行離心，然后在超凈臺(tái)中將上清液棄掉，加入1ml凍存液，放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇，以保證梯度降溫），立即放入一80℃冰箱內(nèi)，第二天轉(zhuǎn)入液氮中，可以保存至少兩年。

凍存液的配制：70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染及處理辦法：

細(xì)菌：在倒置顯微鏡下呈現(xiàn)細(xì)沙狀，培養(yǎng)基肉眼可見(jiàn)的變渾濁，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的影響。

處理：建議在培養(yǎng)基中添加抗生素，預(yù)防用藥比污染后用藥效果更好。清理掉所有污染的細(xì)胞，并重新對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)箱和細(xì)胞培養(yǎng)所用的耗材進(jìn)行高壓滅菌。

真菌：一般培養(yǎng)基不會(huì)變渾濁，保持清亮，顯微鏡下可觀察到絲狀物，有的真菌剛開(kāi)始會(huì)像細(xì)胞碎片，慢慢會(huì)長(zhǎng)出黑色絲狀物，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的影響。

處理：一旦有真菌污染，建議丟棄所有被污染的細(xì)胞，并重新對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)箱和細(xì)胞培養(yǎng)所用的耗材進(jìn)行高壓滅菌。

霉菌：一般培養(yǎng)基仍然清澈但顏色會(huì)變黃，顯微鏡下可觀察到絲狀物和團(tuán)塊狀漂浮物，有明顯的菌絲，在細(xì)胞培養(yǎng)后期會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有影響。

處理：建議扔掉已經(jīng)污染的細(xì)胞，用過(guò)氧乙酸擦拭培養(yǎng)箱，紫外線(xiàn)照射細(xì)胞間，并在培養(yǎng)基中添加兩性霉素，預(yù)防再次污染。

原蟲(chóng)：培養(yǎng)基有輕微渾濁，顯微鏡下可見(jiàn)點(diǎn)狀物增多，培養(yǎng)皿底變臟，用高倍鏡觀察可看到點(diǎn)狀物有輕微活動(dòng)，一般不細(xì)胞活力。

處理：可以用緩沖溶液，如PBS多沖洗幾次。并注意實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)，更換新的培養(yǎng)基等。

黑膠蟲(chóng)：一般培養(yǎng)基維持清亮狀態(tài)，低倍可觀察到黑色點(diǎn)狀，有時(shí)候像細(xì)胞碎片，高倍鏡可觀察到黑色點(diǎn)狀或桿狀物做布朗運(yùn)動(dòng)。往往和細(xì)胞密度相關(guān)，細(xì)胞密度高，黑點(diǎn)少，對(duì)細(xì)胞影響較小。目前關(guān)于黑膠蟲(chóng)說(shuō)法不一，有人認(rèn)為是一些細(xì)菌或真菌污染。

處理：可以用緩沖溶液，如PBS多沖洗幾次，有一定的緩解作用。建議更換所有的培養(yǎng)基，用質(zhì)量好的血清，穿戴清潔的白大衣。同時(shí)對(duì)耗材、細(xì)胞培養(yǎng)箱滅菌，對(duì)細(xì)胞間進(jìn)行消毒。

支原體：培養(yǎng)基一般無(wú)變化，有時(shí)在顯微鏡下也很難觀察到具體變化，有時(shí)可觀察到細(xì)胞膜及細(xì)胞間隙有很多不動(dòng)的黑點(diǎn)。對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及狀態(tài)有所影響。

處理：建議對(duì)耗材、細(xì)胞培養(yǎng)箱滅菌，對(duì)細(xì)胞間進(jìn)行消毒。同時(shí)在培養(yǎng)基中添加支原體清除劑。

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