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三天征服Chip的經(jīng)驗(yàn)分享
發(fā)布時(shí)間： 2021-09-13 點(diǎn)擊次數(shù)： 2585次在科研界，CHIP 無(wú)疑是高冷的女神，在追逐的過(guò)程總是分分鐘虐得體無(wú)完膚，糟心的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更是分分鐘想去“狗帶"。征服 CHIP 的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。慶幸的是，曾得到女神青睞的前輩們積累了不少經(jīng)驗(yàn)。好的經(jīng)驗(yàn)要分享，特地總結(jié)了各位高手們做 CHIP 的經(jīng)驗(yàn)，在此奉上，希望能助大家一臂之力。
染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，CHIP）是目前研究體內(nèi) DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的*方法，能夠比較真實(shí)的反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子 TF 與啟動(dòng)子 Promoter 的結(jié)合情況。其基本原理：在活細(xì)胞狀態(tài)下，把胞內(nèi) DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)成復(fù)合物，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的小片段，然后利用抗原抗體特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白結(jié)合的 DNA 沉淀下來(lái)，特異性富集目的蛋白結(jié)合 DNA 片段，進(jìn)而對(duì)目的片斷進(jìn)行純化與檢測(cè)（如 qPCR、基因芯片、測(cè)序等），從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。
CHIP 主要分為兩種：交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（Cross-linkedChip，XChip）和自然染色質(zhì)免疫沉淀（Native Chromatin Immunoprecipitation, NChip）。兩者的區(qū)別在于 XCHIP 需要甲醛固定，適合于結(jié)合力較弱的 DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究；而 NCHIP 則不需要甲醛固定，不需要交聯(lián)反應(yīng)，主要用于組蛋白修飾（如組蛋白 H3 和 H4，它們本身與 DNA 結(jié)合非常緊密）、核小體定位的研究。在 NCHIP 中，DNA 結(jié)合蛋白與 DNA 之間保持一種自然狀態(tài)，需要采用微球菌核酸酶對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行消化。 一般而言，我們所提的染色質(zhì)免疫共沉淀指的是 XCHIP。那么長(zhǎng)話短說(shuō)，將 XCHIP 三天實(shí)驗(yàn)中的常見流程及注意事項(xiàng)分享給大家。
第一天
細(xì)胞的甲醛交聯(lián)
1）收集細(xì)胞，加入甲醛（終濃度為 1%），37℃孵育 10min 后，加入甘氨酸（終濃度為 0.125M），混勻后在室溫下放置 5min 即可。
2）離心棄上清，收細(xì)胞于 15ml 離心管中，用 3ml 預(yù)冷的 1×PBS 洗兩次后，預(yù)冷后 2000rpm 5min 收集細(xì)胞。
3）棄上清，按照細(xì)胞量，加入 SDS Lysis Buffer，使細(xì)胞濃度為 1×106 個(gè)/100 ul。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。
Tip:
1、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)要好，因其生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響細(xì)胞內(nèi)部的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能會(huì)影響你所研究的 TF 與 Promoter 的結(jié)合。因而，一般細(xì)胞長(zhǎng)到 75%-80%比較好。
2、交聯(lián)程度會(huì)影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段，背景色加深；交聯(lián)不充分，則只有一部分靶蛋白與 Promoter 結(jié)合，富集得到的 Promoter 的量不高，產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)假陰性。建議樣品交聯(lián)的時(shí)間為 2-30min。
3、用 SDS 重懸細(xì)胞時(shí)，要選用小的 tip 頭，在液面下吹打，否則很容易產(chǎn)生氣泡，會(huì)對(duì)后續(xù)超聲破碎帶來(lái)不便。
超聲破碎
1）冰上孵育 10min 后，利用超聲波或微球菌酶將染色質(zhì)隨機(jī)切為 200~1000bp 的小片段。 14000rpm 離心 10min（4℃），轉(zhuǎn)移上清于 1.5ml EP 管中。
2）取出 100ul 超聲破碎產(chǎn)物，加入 4ul 5M NaCl（終濃度為 0.2M），65℃處理 4h 進(jìn)行解交聯(lián)，電泳檢測(cè)超聲破碎的效果。
3）另取出 100ul 超聲破碎產(chǎn)物，加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20 ul 的 50× PIC，再加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，去除非特異性。4℃顛轉(zhuǎn)混勻 1h 后，1000rpm 離心 3min，收集上清。
Tip:
1、不同細(xì)胞系需不同的超聲時(shí)間才能達(dá)到*效果，則可通過(guò)時(shí)間梯度的超聲來(lái)選擇*超聲條件。
2、每份超聲樣品取 50ul，標(biāo)記為 input，用于定量 DNA 濃度（稀釋 200 倍，測(cè) OD260）和作為 PCR 空白對(duì)照。同時(shí)超聲后樣品應(yīng)立刻存于-70℃中，避免多次反復(fù)凍融。
3、加入 Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 之前一定要混勻，因?yàn)?Salmon sperm DNA 是很粘稠的物質(zhì)，若不混勻，后面 beads 量不一樣，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。
第二天
免疫共沉淀
1）一管加入 1ul 抗體，另一管中則不加抗體作為對(duì)照。4℃顛轉(zhuǎn)過(guò)夜。
2）孵育過(guò)夜后，每管加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，沉淀抗體/抗原復(fù)合物， 4℃顛轉(zhuǎn) 1h。1000rpm 4℃ 3min 收集沉淀，棄上清。
Tip:
1、每個(gè)樣品都采用 25ug 的 DNA 量，同時(shí)抗體的量為 1-10ug 的抗體/25ulDNA。
2、單抗與多抗的選擇也需慎重考慮。單抗特異性強(qiáng)，背景低，但是識(shí)別位點(diǎn)單一，在 CHIP 甲醛交聯(lián)過(guò)程中，很有可能該位點(diǎn)被其他蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識(shí)別靶蛋白。多抗雖然沒(méi)有此問(wèn)題，但是特異性差，背景可能會(huì)偏高。一般建議選擇多抗；選擇單抗時(shí)要注意其識(shí)別位點(diǎn)需遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域。
純化 DNA 片段
1）依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗過(guò)程：加入溶液 1ml，在 4℃旋轉(zhuǎn) 5min，1000rpm 3min，去除上清。
洗滌液： 低鹽免疫復(fù)合物洗脫液，洗一次；高鹽免疫復(fù)合物洗脫液，洗一次；氯化鋰免疫復(fù)合物洗脫液，洗一次； TE Buffer，洗兩次。
2）清洗完畢后，進(jìn)行洗脫。每管加入 250ul 洗脫液，室溫下顛轉(zhuǎn) 15min，1000rpm 3min，收集上清液。最終的洗脫液為每管 500ul。
洗脫液： 100ul 10% SDS，100ul 1M NaHCO3 ，800ul ddH2O ，共 1ml。
3）解交聯(lián)：每管加入 20ul 5M NaCl（終濃度為 0.2M），混勻后，65℃解交聯(lián)過(guò)夜。
Tip:
1、洗滌時(shí)，前幾個(gè)步驟可以不用洗的太干凈，但最后一個(gè)要盡量吸取干凈，必要時(shí)可用 gel loading tips 吸取上清液。
2、含 beads 的樣品離心時(shí)，轉(zhuǎn)速不能太快，防止 beads 破碎，但如果采用的是磁性的 beads 就不存在這個(gè)問(wèn)題。
3、解交聯(lián)時(shí)，建議在離心前，先把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來(lái)。
第三天
DNA 樣品的回收
1）每管加入 1ul RNaseA（MBI），37℃孵育 1h。
2）每管加入 10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（pH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45℃處理 2h。
3）DNA 片段回收—OMEGA 膠回收試劑盒，最終的樣品溶于 100ul ddH2O
Tip:
1、樣品中 SDS 含量較高時(shí)，普通 PCR 回收試劑盒進(jìn)行 DNA 片段回收時(shí)，在過(guò)柱前，可在樣品中加入一定量的異丙醇，這樣可有效消除 SDS 沉淀。
2 、一個(gè) CHIP 一般需要 3~4 天時(shí)間，其中有幾個(gè)步驟是可以停下來(lái)的：
（1）細(xì)胞收集：用含蛋白酶抑制劑的 PBS 洗滌離心，去上清的細(xì)胞收集液可置-80℃凍存；
（2）用 SDS 重懸細(xì)胞后可置-80℃凍存；
（3）超聲破碎結(jié)束時(shí)，離心后的上清置新的離心管后可置-80℃凍存；
（4）解交聯(lián)后的標(biāo)本可置-80℃凍存
DNA 樣品分析
如果目的蛋白的靶序列已知，或懷疑某一序列是目的蛋白靶序列，可選用定量或者半定量 PCR 方法。如果目的蛋白的靶序列未知或要研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，則可采用 CHIP 克隆測(cè)序（CHIP-seq）、CHIP-chip 等方法。
PCR 分析
目前檢測(cè)方法主要有 3 種：
CHIP-qPCR：用于比較沉淀的模板與陰性和陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)精確的定量 PCR 方法。成本較低。此外，還有一些由 ChIP 衍生出來(lái)的方法，如 RIP（即用 ChIP 的方法研究細(xì)胞內(nèi) 蛋白與 RNA 相互結(jié)合，具體方法和 ChIP 差不多，只是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意防止 RNase，最后 分析時(shí)需先將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA）
Tip :
1、1~10ul 的移液槍取 3ul 以上才比較準(zhǔn)確，要考慮好自己 PCR 反應(yīng)體系的配置。
2、每次 qPCR 之前都要把 sample 離心保證取樣的準(zhǔn)確。
CHIP-chip：Chip 和 DNA 微陣列芯片技術(shù)結(jié)合是種高通量分析 DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合或翻譯后染 色質(zhì)和組蛋白修飾的方法。即將經(jīng)過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀的 DNA 樣品純化后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 然后用熒光素標(biāo)記（如 Cy3）。對(duì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)免疫沉淀反應(yīng)富集的 Input DNA 樣品也進(jìn)行擴(kuò)增， 并且用另一種熒光素標(biāo)記（如 Cy5），作為結(jié)合背景的參照。之后將這兩種 DNA 雜交于包括 基因組序列的微陣列芯片上，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶序列用每個(gè)點(diǎn)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度來(lái)確定。
CHIP-seq：在測(cè)序深度和范圍足夠的情況下,ChIP-seq 可以檢測(cè)到所有的組蛋白修飾所對(duì)應(yīng)的 DNA 結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-seq 首先通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)特異地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段,并對(duì)其進(jìn)行純化與文庫(kù)構(gòu)建,然后以 NGS 技術(shù)對(duì)富集到的 DNA 片段進(jìn)行高通量測(cè)序。
（NGS 技術(shù)主要是利用 DNA 新模板的合成或連接過(guò)程, 用高效平行的方式同時(shí)對(duì) DNA 模板 進(jìn)行測(cè)序, 從而獲得大量的測(cè)序數(shù)據(jù), 即所謂的大規(guī)模平行測(cè)序。）
- 下一篇：蛋白樣品的制備與定量
- 上一篇：CO-IP沒(méi)有條帶的常見原因和解決的辦法
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