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【蛋白技術(shù)】蛋白標(biāo)簽TAG是什么高大上的東西？

發(fā)布時(shí)間： 2021-09-03　　點(diǎn)擊次數(shù)： 5943次

首先，蛋白標(biāo)簽（proteintag）是什么？
蛋白標(biāo)簽（proteintag）是指利用 DNA 體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測、示蹤和純化等。
蛋白標(biāo)簽大體可分為三大類：遺傳標(biāo)簽、in vivo 標(biāo)簽和 in vitro 標(biāo)簽。大家最熟悉的莫過于遺傳標(biāo)簽，即 c-Myc、FLAG 等：將目的基因克隆到含有標(biāo)簽的載體上，以便下游通過抗體或熒光檢測。同時(shí)，標(biāo)簽的存在也方便了蛋白純化。

下面就介紹幾款常用的 tag 給大家掃掃盲：
名聲在外的 Flag-tag:
Flag 標(biāo)簽蛋白為編碼 8 個(gè)氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時(shí)載體中構(gòu)建的 Kozak 序列使得帶有 FLAG 的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。
優(yōu)點(diǎn)：
FLAG 作為融合表達(dá)標(biāo)簽，其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且通常不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)；
融合 FLAG 的目的蛋白，可以直接通過 FLAG 進(jìn)行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高；
FLAG 作為標(biāo)簽蛋白，其可以被抗 FLAG 的抗體識(shí)別，這樣就方便通過 Western Blot、ELISA 等方法對含有 FLAG 的融合蛋白進(jìn)行檢測、鑒定。
融合在 N 端的 FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn) FLAG 標(biāo)簽已廣泛的應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。

平易近人的 His6-tag：
His6 是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的 C 末端或 N 末端。當(dāng)某一個(gè)標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測；二是構(gòu)成*的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進(jìn)行分離純化。
優(yōu)點(diǎn)：
標(biāo)簽的分子量小，只有~0.84KD，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；
His 標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化；
His 標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA 相互作用研究；
His 標(biāo)簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫制備抗體；
可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。

高大上的 GST-tag:
GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶) 標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為 26KD。
將它應(yīng)用在原核表達(dá)的原因大致有兩個(gè)：
一個(gè)是因?yàn)樗且粋€(gè)高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；
另一個(gè)是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用。
GST 融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用 10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST 標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)情況下 GST 融合蛋白是*或部分可溶的。
純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的 GST 標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹脂進(jìn)行純化。GST 標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST 在變性條件下會(huì)失去對谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。
如果要去除 GST 融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。
檢測：可用 GST 抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測。

常規(guī)化的 c-Myc-tag
C-Myc 標(biāo)簽蛋白，是一個(gè)含 11 個(gè)氨基酸的小標(biāo)簽，標(biāo)簽序列 Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-GluGlu-Asp-Leu，這 11 個(gè)氨基酸作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識(shí)別其相應(yīng)抗體。 C-Myc tag 已成功應(yīng)用在 Western-blot 雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中, 可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。

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【蛋白技術(shù)】蛋白標(biāo)簽TAG是什么高大上的東西？