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【RNA提取】RNA抽提的三大紀(jì)律八項(xiàng)注意！
發(fā)布時間： 2021-08-30 點(diǎn)擊次數(shù)： 3807次今天我們談一談 RNA 抽提的問題。為了方便大家記憶，總結(jié)出了“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意"。
紀(jì)律一：無外源酶的污染。
外源酶會造成 RNA 的降解，造成 RNA 得率太低，或者*失敗。而外源酶又是無處不在的。這就要求注意以下三點(diǎn)：
注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。手指和呼吸時重要的外源酶的來源。所以童鞋們做 RNA 抽 提的時候，還是要全副武裝起來。這對自己也是一種保護(hù)措施。
注意二：實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，槍頭，移液器，實(shí)驗(yàn)臺面等要*處理。離心管和槍頭要用 DEPC 處理過，單純的消毒滅菌可不行呀。移液器和實(shí)驗(yàn)臺面等要用 75%的酒精擦過。
注意三：實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。
紀(jì)律二：無內(nèi)源酶的活性。
這個和紀(jì)律一是一脈相承的。目的都是減少 RNA 的降解，提高最終的得率。而所有的組織都含有內(nèi)源酶，這就要求我們在實(shí)驗(yàn)過程中，千方百計(jì)滅活內(nèi)源酶。這也就誕生了下面的四大注意事項(xiàng)：
注意四：選擇合適的勻漿方法。新鮮樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃ 冰箱保存。在碾磨前，碾磨用具也必須預(yù)冷。在碾磨過程中，一邊碾磨，一邊補(bǔ)充液氮。樣品碾碎后，在液氮剛剛揮發(fā)完時，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。
注意五：選擇合適的裂解液?，F(xiàn)在市場上常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性。但是，高內(nèi)源酶含量的樣品，如肝臟，脾臟等組織，建議使用含苯酚的裂解液。苯酚的滅活內(nèi)源酶的能力是很強(qiáng)的。
注意六：控制好樣品的起始量。如果樣品的塊頭太大，所有的細(xì)胞無法迅速和裂解液接觸。里面沒有接觸到細(xì)胞的 RNA 很快就會被內(nèi)源酶降解。所以，起始量不要太大。如果塊頭太大，要把它切成小塊小塊的。
紀(jì)律三：明確抽提目的。
我們做每一個實(shí)驗(yàn)，甚至每一個步驟，都要清楚這樣子做的目的是什么。RNA 用于不同的實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量的要求是不一樣的。那么，這就誕生了下面的最后兩條紀(jì)律：
注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。所以，要進(jìn)行樣品的破碎和勻漿。其目的是為了使 RNA *地完整地釋放出來。如果樣品是細(xì)胞，則無須破碎即可直接勻漿；如果是組織，甚至器官，那就需要破碎后才能勻漿；如果是酵母菌和細(xì)菌，則需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。
注意八：RNA 抽提成功的一個經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功，而不是得率。我們?yōu)槭裁匆樘?RNA？是為了后面的實(shí)驗(yàn)，例如原位雜交，免疫沉淀等等。所以，一定要明確后面到底是要干嘛？cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶 反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。不用每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，從而造成不必要的浪費(fèi)。
綜上所述，對大部分實(shí)驗(yàn)者來說，RNA 抽提比 DNA 抽提要困難得多。所以，我們要個個牢記，三大紀(jì)律八項(xiàng)注意。
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